Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

ВАЛИДАЦИОННАЯ ОЦЕНКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНИЛОКАИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Сабирзянов Д.Р. 1 Карпенко Ю.Н. 1
1 ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Минздрава России
Разработана и валидирована методика количественного определения местного анестетика анилокаина в плазме крови на основе микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием. Биоаналитическая методика включает осаждение белков плазмы, жидкость-жидкостную экстракцию аналита и хроматографическое определение. Разделение проводили на колонке с обращено-фазным сорбентом ProntoSIL120-5C18 AQ в условиях градиентного элюирования при использовании в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрил – 0,1% водный раствор кислоты трифторуксусной. Методика была подвергнута процедуре валидации в соответствии с современными требованиями, предъявляемыми к биоаналитическим методикам. Продемонстрирована хорошая линейность в диапазоне концентраций анилокаина 42-2100 нг/мл (коэффициент корреляции 0.996). Анализ контрольных образцов качества показал удовлетворительные значения показателей прецизионности (CV % не более 9) и правильности (ε,% не более 4).
обращённо-фазная ВЭЖХ.
валидация
фармакокинетические исследования
анилокаин
1. Медведев Ю.В. ВЭЖХ и СВЭЖХ как методы для определения лекарственных веществ в крови (обзор) / Раменская Г.В.., Шохин И.Е., Ярушок Т.А. // Химико-фармацевтический журнал. – 2013. – Том 47, №14. – С. 45-51.
2. Панцуркин В.И., Алексеева И.В. Анилокаин, поиск, свойства. Начальный опыт применения лекарственных форм в медицинской практике: монография. – Пермь: Изд-во ГОУ ВПО ПГФА Роздрава, 2006. – 174 с.
3. Рейхарт Д.В. Высокочувствительные методы в оценке биоэквивалентности лекарственных препаратов (обзор) / Рейхарт Д.В., В.В. Чистяков // Химико-фармацевтический журнал. – 2009. – Том 43, №12. – С. 39-46.
4. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том III. — М.: ПОЛИГРАФ-ПЛЮС, 2014 — 344 с.
5. Сабирзянов Д.Р. Оптимизация условий пробоподготовки плазмы к хроматографическому исследованию для изучения фармакокинетики анилокаина / Сабирзянов Д.Р., Карпенко Ю.Н. // Современная фармация: образование, наука, бизнес: сборник мат. науч.-практ. конференции с международным участием, посвящ. 50-летию фармацевтического факультета – Тюмень, 2014. – С.193-195.
6. Федорова Г.А. Применение микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии в медицине / Кожанова Л.А., Полянская Е.М. // Вестник восстановительной медицины. – 2008. – №1(23). – С. 35-41.
Анилокаин [2’-броманилида-3-диэтиламинопропановой кислоты гидрохлорид]  является представителем местноанестезирующих средств из группы замещенных амидов. Сочетание доказанной высокой эффективности анилокаина при различных видах анестезии и сопутствующей противовоспалительной и умеренной антимикробной активности  выгодно отличают его от импортных аналогов, применяемых в медицинской практике [2]. В Пермской государственной фармацевтической академии (ПГФА) на основе анилокаина разработаны и доведены до медицинского применения 1% и 2% инъекционные растворы, 5% раствор для наружного применения, мазь «Аникол», перевязочные средства длительного действия. В настоящее время на кафедре фармацевтической технологии продолжаются  исследования по созданию  других  лекарственных форм с перспективой внедрения их в медицинскую и ветеринарную практику (суппозитории, пленки лекарственные, обезболивающий гель, аэрозоль и т.д.).

Изучение фармакокинетических параметров потенциального препарата, одного из важнейших этапов доклинических и клинических исследований, невозможно без разработки высокочувствительных, точных и воспроизводимых методик определения его в биологических объектах. Лидирующее место среди методов определения лекарственных средств в биологическом материале, в том числе при изучении фармакокинетики, занимает высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с различными видами детектирования [1, 3]. Микроколоночная ВЭЖХ в силу дополнительных преимуществ, таких как экспрессность, экономичность, удовлетворительные метрологические характеристики в настоящее время активно используется для решения сложных медицинских задач в области лекарственного терапевтического мониторинга и фармакокинетических исследований [6]. В связи с этим, целью настоящей работы явилась разработка и валидация методики определения анилокаина в плазме крови методом микроколоночной обращённо-фазной ВЭЖХ для целей изучения фармакокинетики.

           Материалы и методы исследования

            В работе использовали микроколоночный жидкостный хроматограф "Милихром А- 02" (ЗАО ИХ "ЭкоНова", Новосибирск, Россия) с колонкой размером  2х75 мм, заполненной  обращено-фазным сорбентом ProntoSIL 120-5C18 AQ (Bishoff, Германия), и спектрофотометрическим детектором. Обработку хроматографической информации  осуществляли при помощи программного обеспечения «Мультихром».

В работе использована субстанция анилокаина (ВФС 42-2946-97), синтезированная в ПГФА. В качестве биологической матрицы для приготовления калибровочных стандартов и контрольных образцов использовали плазму крови человека, полученную со станции переливания крови. Плазму хранили в сверхнизкотемпературном морозильном аппарате при температуре не выше 60°С.

Концентрированный раствор анилокаина с концентрацией 1 мг/мл был приготовлен путем растворения в метаноле. Рабочие растворы готовились путем соответствующих разведений исходных растворов водой. Калибровочные стандарты и контрольные образцы качества анилокаина готовили из рабочих растворов путем их разведения в бланковой плазме.

            Для приготовления элюентов использовали воду, полученную в системе очистки воды Simplicity UV, кислоту трифторуксусную кислоту, ацетонитрил для хроматографии (сорт 0, Криохром, Санкт-Петербург).

 

           Результаты исследований и их обсуждение

Проведенные ранее исследования по оптимизации условий изолирования анилокаина из плазмы крови показали, что в условиях модельного эксперимента максимальное излечение вещества (≈83%) наблюдается при использовании жидкость-жидкостной экстракции из щелочной среды после предварительного осаждения белков плазмы ацетонитрилом [5]. Для определения анилокаина в извлечениях использовали метод микроколоночной ВЭЖХ. Оптимальные результаты хроматографического разделения анилокаина и соэкстрактивных веществ были получены  при градиентном элюировании в следующих условиях:

-         элюент А – 0,1% раствор трифторуксусной кислоты, элюент В – ацетонитрил;

-         режим элюирования градиентный: возрастание доли ацетонитрила с 10% до 70% за 20 минут, регенерация колонки 10% раствором ацетонитрила – 800 мкл;

-         скорость потока элюента – 100 мкл/мин;

-         детектирование – многоволновое  (опорная длина волны - 210 нм, вспомогательные длины волн: 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм); 

-         температура термостата – 40°С;

-         объем вводимой пробы – 20 мкл.

В данных условиях абсолютное время удерживания анилокаина составляет ≈ 9,5 мин.

Валидационную оценку биоаналитической методики проводили по следующим параметрам: специфичность, линейность, правильность, прецизионность, предел обнаружения и количественного определения, стабильность [4].

Специфичность разработанных условий была оценена путем сравнения хроматограмм экстрактов холостого образца плазмы и модельной смеси плазмы с известным содержанием аналита. Примеры хроматограмм приведены на рис.1-2.

Рис.1. Хроматограмма извлечения из бланковой плазмы (холостой опыт)

Рис.2. Хроматограмма извлечения из модельной смеси плазмы с содержанием анилокаина (500 нг/мл)

Анализ хроматограмм «холостого» опыта показал отсутствие пиков эндогенных  веществ плазмы на времени выхода анилокаина. Коэффициент разделения пика анилокаина и соседних пиков составил не менее 5.

Для установления линейности методики были проанализированы 8 образцов модельных смесей плазмы с содержанием анилокаина от 42 до 2100 нг/мл. Результаты представлены на рис.3 и таблице 1.

Градуировочная зависимость описывается уравнением S =0,0024×С (S – площадь хроматографического пика, С – концентрация анилокаина в плазме, нг/мл), коэффициент корелляции R2 составил 0.9963. Предел количественного определения анилокаина в плазме по предложенной методике – 40 нг/мл.

Таблица 1

Отклонения концентраций калибровочных стандартов от фактических значений

С факт., нг/мл

42

105

210

525

840

1050

1575

2100

С рассч., нг/мл

37,5

112,5

205,0

508,3

862,5

1125,0

1500,3

2033,3

ε,%

–10,7

7,1

–2,4

–3,2

2,7

7,1

–4,8

–3,2

 

Рис.3. Зависимость площади пика от концентрации анилокаина (нг/мл) в калибровочных стандартах

 

Полученные отклонения концентраций калибровочных стандартов от фактических значений соответствуют современным требованиям, предъявляемым к биоаналитическим методикам [4].

Для оценки параметров методики «Прецизионность» и «Правильность»  готовили по 6 модельных образцов плазмы на 5 уровнях концентраций  анилокаина: 39; 117; 468; 936, 1404 нг/мл (контрольные образцы качества). Подготовку образцов для анализа осуществляли в соответствии с описанной методикой. Прецизионность и правильность методики оценивалась по величинам относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (ε,%) соответственно. Метрологические характеристики методики представлены в таблице 2. Полученные результаты контроля не превышают 15%, допускаемых для биоаналитических методик, что свидетельствует об отсутствии значимых систематических ошибок в результатах анализа [4].

Таблица 2

 Прецизионность и правильность методики количественного определения анилокаина в плазме крови методом ВЭЖХ

Концентрация анилокаина в модельной  смеси, нг/мл

 

Найденная концентрация (нг/мл), , (n = 6)

SD

 

RSD,%

ε,%

39

40,3

(44,6; 37,9; 40,1; 34,7; 42,8; 41,8)

3,5

8,7

3,3

117

119,5

(122,4; 126,0; 107,1; 128,3; 110,9; 122,5)

8,4

7,1

2,1

468

460,4

(485,5; 451,9; 434,2; 479,9; 444,8; 466,1)

20,1

4,4

-1,6

936

906,8

(911,2; 896,4; 940,2; 903,3; 915,0; 874,9)

16,3

1,8

-3,2

1404

1387,3

(1351,6; 1298,1; 1340,1; 1464,2; 1398,9; 1470,6)

59,2

4,3

-1,2

Изучена стабильность контрольных образцов качества с концентрацией анилокаина 39 и 1404 нг/мл при замораживании/размораживании (3 цикла) и при хранении  в течение 12 часов при комнатной температуре. Доказано, что величина относительной погрешности рассчитанных значений концентраций от фактических не превышает 15%.

Выводы:

1. Разработана методика количественного определения анилокаина в плазме крови методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием.

2. Валидационная оценка показала высокую чувствительность, точность и воспроизводимость методики.

3. Разработанная методика может быть использована для количественного определения анилокаина в плазме крови на этапе доклинических и клинических фармакокинетических исследований препаратов анилокаина.

Рецензенты:

Малкова Т.Л., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой токсикологической химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь;

Ярыгина Т.И., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры фармацевтической химии ФОО ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь.


Библиографическая ссылка

Сабирзянов Д.Р., Карпенко Ю.Н. ВАЛИДАЦИОННАЯ ОЦЕНКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНИЛОКАИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 2-2.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=23077 (дата обращения: 06.04.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074