Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАЦИОННОГО СТАТУСА ГЕНА BRAF В ЗАВИСИМОСТИ ОТ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ МЕЛАНОМЫ КОЖИ

Кит О.И. 1 Водолажский Д.И. 1 Златник Е.Ю. 1 Ефимова И.Ю. 1 Енин Я.С. 1 Кочуев С.С. 1 Двадненко К.В. 1
1 ФБГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России
Меланома кожи человека характеризуется агрессивным течением и резистентностью к стандартной цитостатической терапии. В странах с преимущественно белым населением меланома входит в первую десятку наиболее социально значимых категорий опухолей, как в отношении заболеваемости, так и смертности. Решающим фактором риска развития меланомы кожи является эпизодическое облучение интенсивными дозами ультрафиолета. Для населения, проживающего на Юге России, эта проблема является актуальной в связи с особенностями климатогеографического положения и интенсивностью инсоляции. Целью настоящего исследованиястало определение мутационного статуса гена BRAF у пациентов Юга Россиив зависимости отклинико-морфологических особенностей меланомы кожи. Проведено молекулярно-генетическое исследование 15 экзона гена BRAFметодом секвенирования по Сэнгеруу 52 пациентов Юга России с морфологически подтвержденным диагнозом меланома кожи. В результате исследования выявлено три варианта мутаций в генеBRAF:p.V600E, p.V600K и V600 K601>E.Мутация V600 K601>E была впервые диагностирована на Юге России. 50% меланом содержали замену в 600 аминокислотном остатке киназы BRAF. Усредненный показатель частоты мутаций V600E в 15 экзоне гена BRAF (для мужчин и женщин) составил 47%. Обнаружено достоверное увеличение на 23%случаев частоты проявления соматической мутации V600E в 15 экзоне гена BRAF у пациентов с толщиной опухоли по Бреслоу ≥ 2 мм по сравнению с пациентами, имеющими толщину опухоли по Бреслоу<2 мм. Метастазирование в регионарные лимфатические узлы наблюдалось только в группе пациентов с мутацией в генеBRAF и встречалось в 11,5% случаев.
BRAF.
мутации
меланома кожи
1. ЛюбченкоЛ.Н., ЧерненкоП.А., ХатыревС.А., ЕмельяноваМ.А., Наседкина Т.А., Писарева Е.Е., Коваленко С.П., Шаманин В.А. Клинико-генетическая гетерогенность меланомы кожи // Злокачественные опухоли. – 2012. – Т.2.– №2. – С. 81-90.
2. Berking C., Bosserhoff A.K. Malignant Melanoma // Hereditary tumors / Allgayer H., Rehder H., Fulda S. – WILEY-VCH Verlag GmbH &Co.KgaA, 2009. – P. 411-420
3. Berger MF, Garraway LA. Applications of genomics in melanoma oncogene discovery. Hematol.Oncol.Clin.North.Am. 2009 Jun;23(3):397-414, vii.
4. Davies H, Bignell GR, Cox C, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 2002; 417:949– 954.
5. Davies MA, Samuels Y. Analysis of the genome to personalize therapy for melanoma. Oncogene. 2010 Oct 14;29(41):5545-55. Epub 2010 Aug 9.
6. Long GV, Menzies AM, Nagrial AM, et al. Prognostic and clinicopathologic associations of oncogenic BRAF in metastatic melanoma. J ClinOncol. 2011 Apr 1;29(10):1239-46. Epub 2011 Feb 22.
7. MillerA.J., MihmM.C. Jr. Melanoma. NEnglJMed. 2006; 355: 51—65.
 Заболеваемость меланомой кожи колеблется от ~1 до 55 случаев на 100 тыс. человек в год, в зависимости от географического положения, поведенческих особенностей и расовой принадлежности изучаемой популяции.Индивидуальный риск развития данной патологии в странах с преимущественно белым населением составляет 2%. В онкодерматологиина меланомуприходится 4% от общего числа новообразований, и она является причиной около 80% летальных исходов от онкологических заболеваний. Меланома кожи – одна из наиболее агрессивных форм солидных опухолей, которая характеризуется устойчивостью к стандартной химиотерапии. В связи с этим, 5-летняя выживаемость больных с метастатическим процессом меланомы кожи не превышает 10-15%[7].В странах с преимущественно белым населением меланома входит в первую десятку наиболее социально значимых категорий опухолей, как в отношении заболеваемости, так и смертности [7]. Меланома кожи является этиологически гетерогенным заболеванием, и ее развитие зависит как от генетических, так и от факторов внешней среды.  Различают наследственную и спорадическую формы. Частота спорадической меланомы составляет около 90%, а наследственной – 5-10%[2]. В молекулярном патогенезе спорадической меланомы основную роль играют онкогены и гены-супрессоры различных сигнальных каскадов.  В подавляющем большинстве случаев меланомы кожи  наблюдается гиперактивация  сигнального пути  RAS-RAF-MEK-MAPK,регулирующего клеточное деление, дифференцировку и метастазирование[3]. Одним из его ключевых звеньевслужитсерин-треониноваякиназа, кодируемая геном BRAF. Мутации в генеBRAF проявляются в 40-80% случаев меланомы кожи. На сегодняшний день известно около 40 соматических мутаций в генеBRAF[5].Наиболее часто встречаемой является активирующая точковая мутация T1799A (V600E), приводящая к замене валина на глутаминовую кислоту в 600 аминокислотном остатке соответствующего полипептида,частота которой составляет около 80-90% среди всех мутаций в генеBRAF [4]. Кроме того, c частотой до 20% от всех случаев выявляется мутация V600K, приводящая к замене валина на аспарагин [6].

Целью настоящего исследованияявляется определениемутационного статусагена BRAF, в зависимости от клинико-морфологических особенностей меланомы кожиу пациентов Юга России.

Материалы и методы

В исследовании участвовали 52 пациента Юга России и Северного Кавказа: 22 мужчины и30 женщинв возрасте до 55 лет с морфологически подтвержденным диагнозом меланома кожи.Для молекулярно-генетического исследования использовали 3 мкм срезы парафиновых блоков (FFPE), содержащих не менее 20% опухолевых клеток. Экстракция ДНК включала стандартную процедуру депарафинирования в орто-ксилоле, лизис в 2% SDS- буфере в присутствии протеиназы K и дополнительную очистку от ингибиторов на колонках QIAamp® DNA FFPE TissueKit (QIAGENE, Germany).Для проведения ПЦР концентрацию ДНК нормализовывали до величины 2 нг/мкл. Полимеразная цепная реакция для 15 экзона гена проводилась с использованием пары праймеров5’-TGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGA-3’ и 5’-AACTCAGCAGCATCTCAGGG-3’. Амплификация проводилась на программируемом термоциклереMaxyGeneGradient (Axygen) по программе, включавшей: первичную денатурацию при 95оС – 5 минут и 40 циклов в режиме: денатурация - 95оС – 15 сек., отжиг – 66оС-15 сек., синтез при 72оС - 20 сек. и заключительная элонгация 72оС – 30 мин.Секвенирование проводилось по стандартному протоколу для набора ABIPrismBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKits на амплификатореMaxyGeneGradient (Axygen) по следующей программе: первичная денатурация при 96оС – 1минута и 30 циклов в режиме: денатурация - 96оС – 10 сек., отжиг - 50оС - 5 сек., синтез при 72оС-4 мин.

Определение последовательности нуклеотидов образцов проводили на секвенатореABIPrism 3500(LifeTechnologies, USA).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием непараметрического критерия c2для порогового уровня p<0.05.

Результаты и обсуждение

Для изучения мутационного статуса гена BRAFв зависимости от клинико-морфологических характеристик меланомы кожи больные были разделены на 2 группы: с мутацией вгенеBRAF - mtBRAF (n=26) и без мутации - wtBRAF (n=26).В результате проведенного исследования была определена общая частота проявления соматической мутации V600E в генеBRAF, которая составила 47% (24/51 пациентов), что согласуется с данными, полученными ранее в исследованиях [1].При исследовании мутационного статуса гена BRAF в объединенной группе мужчин и женщин с меланомой кожи были обнаружены следующие мутации:p.V600E(92%), характеризующаяся нуклеотидной заменойT на A в положении 1799, в результате чего происходит замена аминокислоты валина на глутаминовуюкислоту в положении 600. Мутация p.V600K (4% от общего количества мутаций), характеризующаяся заменойдвух нуклеотидов GTна AAв положении 1798-1799 и приводящая к замене аминокислоты валина на аминокислоту аспарагин в положении 600.Мутация p.V600 K601>E(4% от общего количества мутаций), характеризующаяся делецией трех нуклеотидов TGAв положении 1799-1801 и сдвигом рамки считывания.

 

Как показали результаты нашего исследования (Табл. 1), в группе пациентов с размером опухолей Т1частота встречаемости дикого типагенаBRAFстатистически достоверно была более чем в три раза выше, чем mtBRAF(p=0,0001).

В группах пациентов с размером опухолей Т3 и Т4 количество пациентов с mtBRAF было ~на 20 % больше, чем с wtBRAF (Таблица 1), что может говорить в пользу высокой скорости деления клетокBRAFассоциированной меланомы кожи[1].

Таблица 1

Зависимость размера опухоли от мутационного статуса гена BRAF

 

T1

T2

T3

T4

 

wt BRAF

 

77,8%

 

 

53,3%

 

     38,5%

 

     40%

 

mt BRAF

 

   22,2%

 

 

46,7%

 

     61,5%

 

      60%

В группе пациентов с mtBRAFна 23%чаще, чем в группе wtBRAF встречалась толщина опухоли по Бреслоу ≥ 2 мм (р=0,008).

Метастазирование в регионарные лимфатические узлы наблюдалось лишь в группе с мутацией гена BRAF и встречалось в 11,5% случаев. (Табл. 2).

Таблица 2

Характеристика мутационного статуса гена BRAF в зависимости от клинико-морфологических особенностей

Показатели

wtBRAF

mtBRAF

 

Пол

       Мужской

       Женский

 

 

58%  (n=15 )

42 % (n=11 )

 

42 % (n=11 )

58 %  (n=15 )

 

 

      Метастазы в ЛФУ

 

                Присутствуют

 

                 Отсутствуют                          

 

 

 

0 %

 

100%(n=26 )

 

 

 

 

11,5 % (n=3 )

 

88,5% (n=23)

Толщина  по Бреслоу

< 2 мм

≥ 2 мм

 

 

 

50%   ( n=13 )

 50%   ( n=13 )

 

 

 

 27% ( n=7 )

73%(n=19 )

Также в группе мутациив генеBRAFна 16%чаще встречались у женщин (р=0,023),(Табл. 2).

Заключение

Таким образом, при проведении молекулярно-генетического скринингамутаций в 15 экзоне гена BRAF(секвенирование ДНКпо Сэнгеру) у 52 больных Юга России с меланомой кожи нами установлены три варианта мутаций в 15 экзоне гена BRAF: p.V600E, p.V600Kи V600 K601>E (мутация V600 K601>E впервые диагностирована на Юге России).BRAF мутациибыли обнаружены у 50% пациентов: p.V600E в 92%, p.V600K в 4% иV600 K601>Eв4% случаев. Усредненный показатель частоты мутаций V600E в 15 экзоне гена BRAF (для мужчин и женщин) составил 47%. Наблюдалось достоверное увеличение случаев частоты соматической мутации V600E в 15 экзоне гена BRAF у пациентов с толщиной опухоли по Бреслоу ≥ 2 мм на 23%.Метастазирование в регионарные лимфатические узлы наблюдалось лишь в группе с мутацией гена BRAF и встречалось в 11,5% случаев.

 

Рецензенты:

Франциянц Е.М.,д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону;

Горошинская И.А., д.б.н.,профессор, главный научный сотрудник лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ,г. Ростов-на-Дону.


Библиографическая ссылка

Кит О.И., Водолажский Д.И., Златник Е.Ю., Ефимова И.Ю., Енин Я.С., Кочуев С.С., Двадненко К.В. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАЦИОННОГО СТАТУСА ГЕНА BRAF В ЗАВИСИМОСТИ ОТ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ МЕЛАНОМЫ КОЖИ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=22900 (дата обращения: 21.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074