Целью настоящего исследованияявляется определениемутационного статусагена BRAF, в зависимости от клинико-морфологических особенностей меланомы кожиу пациентов Юга России.
Материалы и методы
В исследовании участвовали 52 пациента Юга России и Северного Кавказа: 22 мужчины и30 женщинв возрасте до 55 лет с морфологически подтвержденным диагнозом меланома кожи.Для молекулярно-генетического исследования использовали 3 мкм срезы парафиновых блоков (FFPE), содержащих не менее 20% опухолевых клеток. Экстракция ДНК включала стандартную процедуру депарафинирования в орто-ксилоле, лизис в 2% SDS- буфере в присутствии протеиназы K и дополнительную очистку от ингибиторов на колонках QIAamp® DNA FFPE TissueKit (QIAGENE, Germany).Для проведения ПЦР концентрацию ДНК нормализовывали до величины 2 нг/мкл. Полимеразная цепная реакция для 15 экзона гена проводилась с использованием пары праймеров5’-TGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGA-3’ и 5’-AACTCAGCAGCATCTCAGGG-3’. Амплификация проводилась на программируемом термоциклереMaxyGeneGradient (Axygen) по программе, включавшей: первичную денатурацию при 95оС – 5 минут и 40 циклов в режиме: денатурация - 95оС – 15 сек., отжиг – 66оС-15 сек., синтез при 72оС - 20 сек. и заключительная элонгация 72оС – 30 мин.Секвенирование проводилось по стандартному протоколу для набора ABIPrismBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKits на амплификатореMaxyGeneGradient (Axygen) по следующей программе: первичная денатурация при 96оС – 1минута и 30 циклов в режиме: денатурация - 96оС – 10 сек., отжиг - 50оС - 5 сек., синтез при 72оС-4 мин.
Определение последовательности нуклеотидов образцов проводили на секвенатореABIPrism 3500(LifeTechnologies, USA).
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием непараметрического критерия c2для порогового уровня p<0.05.
Результаты и обсуждение
Для изучения мутационного статуса гена BRAFв зависимости от клинико-морфологических характеристик меланомы кожи больные были разделены на 2 группы: с мутацией вгенеBRAF - mtBRAF (n=26) и без мутации - wtBRAF (n=26).В результате проведенного исследования была определена общая частота проявления соматической мутации V600E в генеBRAF, которая составила 47% (24/51 пациентов), что согласуется с данными, полученными ранее в исследованиях [1].При исследовании мутационного статуса гена BRAF в объединенной группе мужчин и женщин с меланомой кожи были обнаружены следующие мутации:p.V600E(92%), характеризующаяся нуклеотидной заменойT на A в положении 1799, в результате чего происходит замена аминокислоты валина на глутаминовуюкислоту в положении 600. Мутация p.V600K (4% от общего количества мутаций), характеризующаяся заменойдвух нуклеотидов GTна AAв положении 1798-1799 и приводящая к замене аминокислоты валина на аминокислоту аспарагин в положении 600.Мутация p.V600 K601>E(4% от общего количества мутаций), характеризующаяся делецией трех нуклеотидов TGAв положении 1799-1801 и сдвигом рамки считывания.
Как показали результаты нашего исследования (Табл. 1), в группе пациентов с размером опухолей Т1частота встречаемости дикого типагенаBRAFстатистически достоверно была более чем в три раза выше, чем mtBRAF(p=0,0001).
В группах пациентов с размером опухолей Т3 и Т4 количество пациентов с mtBRAF было ~на 20 % больше, чем с wtBRAF (Таблица 1), что может говорить в пользу высокой скорости деления клетокBRAFассоциированной меланомы кожи[1].
Таблица 1
Зависимость размера опухоли от мутационного статуса гена BRAF
|
T1 |
T2 |
T3 |
T4 |
wt BRAF |
77,8%
|
53,3% |
38,5% |
40% |
mt BRAF |
22,2%
|
46,7% |
61,5% |
60% |
В группе пациентов с mtBRAFна 23%чаще, чем в группе wtBRAF встречалась толщина опухоли по Бреслоу ≥ 2 мм (р=0,008).
Метастазирование в регионарные лимфатические узлы наблюдалось лишь в группе с мутацией гена BRAF и встречалось в 11,5% случаев. (Табл. 2).
Таблица 2
Характеристика мутационного статуса гена BRAF в зависимости от клинико-морфологических особенностей
Показатели |
wtBRAF |
mtBRAF |
Пол Мужской Женский
|
58% (n=15 ) 42 % (n=11 ) |
42 % (n=11 ) 58 % (n=15 )
|
Метастазы в ЛФУ
Присутствуют
Отсутствуют |
0 %
100%(n=26 )
|
11,5 % (n=3 )
88,5% (n=23) |
Толщина по Бреслоу < 2 мм ≥ 2 мм
|
50% ( n=13 ) 50% ( n=13 )
|
27% ( n=7 ) 73%(n=19 ) |
Также в группе мутациив генеBRAFна 16%чаще встречались у женщин (р=0,023),(Табл. 2).
Заключение
Таким образом, при проведении молекулярно-генетического скринингамутаций в 15 экзоне гена BRAF(секвенирование ДНКпо Сэнгеру) у 52 больных Юга России с меланомой кожи нами установлены три варианта мутаций в 15 экзоне гена BRAF: p.V600E, p.V600Kи V600 K601>E (мутация V600 K601>E впервые диагностирована на Юге России).BRAF мутациибыли обнаружены у 50% пациентов: p.V600E в 92%, p.V600K в 4% иV600 K601>Eв4% случаев. Усредненный показатель частоты мутаций V600E в 15 экзоне гена BRAF (для мужчин и женщин) составил 47%. Наблюдалось достоверное увеличение случаев частоты соматической мутации V600E в 15 экзоне гена BRAF у пациентов с толщиной опухоли по Бреслоу ≥ 2 мм на 23%.Метастазирование в регионарные лимфатические узлы наблюдалось лишь в группе с мутацией гена BRAF и встречалось в 11,5% случаев.
Рецензенты:
Франциянц Е.М.,д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону;
Горошинская И.А., д.б.н.,профессор, главный научный сотрудник лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ,г. Ростов-на-Дону.
Библиографическая ссылка
Кит О.И., Водолажский Д.И., Златник Е.Ю., Ефимова И.Ю., Енин Я.С., Кочуев С.С., Двадненко К.В. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАЦИОННОГО СТАТУСА ГЕНА BRAF В ЗАВИСИМОСТИ ОТ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ МЕЛАНОМЫ КОЖИ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=22900 (дата обращения: 20.02.2025).