Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF THE BRAF MUTATION STATUS IN DEPENDENCE ON CLINICAL AND MORPHOLOGICAL FEATURES OF MELANOMA

Kit O.I. 1 Vodolazhskiy D.I. 1 Zlatnik E.Yu. 1 Efimova I.Yu. 1 Enin Ya.S. 1 Kochuev S.S. 1 Dvadnenko K.V. 1
1 Rostov Research Institute of Oncology (RNIOI)
Human melanoma is characterized by an aggressive disease course and is resistant to the standard cytotoxic therapy. In countries with a predominantly white population, melanoma is among ten most socially significant tumors in terms of both morbidity and mortality.Occasional high doses of UV radiation are the most important risk factor in melanoma development. This problem is urgent for people in the South of Russia because of the climate and geographical position and insolation intensity. The purpose of the study was to determine the BRAF mutation status in patients in the South of Russia in dependence on clinical and morphological characteristics of melanoma. A molecular genetic study of BRAF exon 15 with the Sanger sequencing method was performed for 52 patients of the South of Russia with morphologically verified melanoma. As a result, three BRAF mutations were detected: p.V600E, p.V600K and V600 K601>E; the last one was diagnosed in the South of Russia for the first time. 50% of melanomas had an amino acid substitution at residue 600 in BRAF. The mean frequency of V600E mutations in BRAF exon 15 (for men and women) was 47%. Patients with melanoma ≥2 mm in Breslow thickness showed somatic V600E mutation in BRAF exon 15 23% more frequent than patients with melanoma <2 mm. Metastases to regional lymph nodes were observed in patients with the BRAF mutations only and amounted to 11.5% of the cases.
BRAF.
mutations
melanoma
 Заболеваемость меланомой кожи колеблется от ~1 до 55 случаев на 100 тыс. человек в год, в зависимости от географического положения, поведенческих особенностей и расовой принадлежности изучаемой популяции.Индивидуальный риск развития данной патологии в странах с преимущественно белым населением составляет 2%. В онкодерматологиина меланомуприходится 4% от общего числа новообразований, и она является причиной около 80% летальных исходов от онкологических заболеваний. Меланома кожи – одна из наиболее агрессивных форм солидных опухолей, которая характеризуется устойчивостью к стандартной химиотерапии. В связи с этим, 5-летняя выживаемость больных с метастатическим процессом меланомы кожи не превышает 10-15%[7].В странах с преимущественно белым населением меланома входит в первую десятку наиболее социально значимых категорий опухолей, как в отношении заболеваемости, так и смертности [7]. Меланома кожи является этиологически гетерогенным заболеванием, и ее развитие зависит как от генетических, так и от факторов внешней среды.  Различают наследственную и спорадическую формы. Частота спорадической меланомы составляет около 90%, а наследственной – 5-10%[2]. В молекулярном патогенезе спорадической меланомы основную роль играют онкогены и гены-супрессоры различных сигнальных каскадов.  В подавляющем большинстве случаев меланомы кожи  наблюдается гиперактивация  сигнального пути  RAS-RAF-MEK-MAPK,регулирующего клеточное деление, дифференцировку и метастазирование[3]. Одним из его ключевых звеньевслужитсерин-треониноваякиназа, кодируемая геном BRAF. Мутации в генеBRAF проявляются в 40-80% случаев меланомы кожи. На сегодняшний день известно около 40 соматических мутаций в генеBRAF[5].Наиболее часто встречаемой является активирующая точковая мутация T1799A (V600E), приводящая к замене валина на глутаминовую кислоту в 600 аминокислотном остатке соответствующего полипептида,частота которой составляет около 80-90% среди всех мутаций в генеBRAF [4]. Кроме того, c частотой до 20% от всех случаев выявляется мутация V600K, приводящая к замене валина на аспарагин [6].

Целью настоящего исследованияявляется определениемутационного статусагена BRAF, в зависимости от клинико-морфологических особенностей меланомы кожиу пациентов Юга России.

Материалы и методы

В исследовании участвовали 52 пациента Юга России и Северного Кавказа: 22 мужчины и30 женщинв возрасте до 55 лет с морфологически подтвержденным диагнозом меланома кожи.Для молекулярно-генетического исследования использовали 3 мкм срезы парафиновых блоков (FFPE), содержащих не менее 20% опухолевых клеток. Экстракция ДНК включала стандартную процедуру депарафинирования в орто-ксилоле, лизис в 2% SDS- буфере в присутствии протеиназы K и дополнительную очистку от ингибиторов на колонках QIAamp® DNA FFPE TissueKit (QIAGENE, Germany).Для проведения ПЦР концентрацию ДНК нормализовывали до величины 2 нг/мкл. Полимеразная цепная реакция для 15 экзона гена проводилась с использованием пары праймеров5’-TGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGA-3’ и 5’-AACTCAGCAGCATCTCAGGG-3’. Амплификация проводилась на программируемом термоциклереMaxyGeneGradient (Axygen) по программе, включавшей: первичную денатурацию при 95оС – 5 минут и 40 циклов в режиме: денатурация - 95оС – 15 сек., отжиг – 66оС-15 сек., синтез при 72оС - 20 сек. и заключительная элонгация 72оС – 30 мин.Секвенирование проводилось по стандартному протоколу для набора ABIPrismBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKits на амплификатореMaxyGeneGradient (Axygen) по следующей программе: первичная денатурация при 96оС – 1минута и 30 циклов в режиме: денатурация - 96оС – 10 сек., отжиг - 50оС - 5 сек., синтез при 72оС-4 мин.

Определение последовательности нуклеотидов образцов проводили на секвенатореABIPrism 3500(LifeTechnologies, USA).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием непараметрического критерия c2для порогового уровня p<0.05.

Результаты и обсуждение

Для изучения мутационного статуса гена BRAFв зависимости от клинико-морфологических характеристик меланомы кожи больные были разделены на 2 группы: с мутацией вгенеBRAF - mtBRAF (n=26) и без мутации - wtBRAF (n=26).В результате проведенного исследования была определена общая частота проявления соматической мутации V600E в генеBRAF, которая составила 47% (24/51 пациентов), что согласуется с данными, полученными ранее в исследованиях [1].При исследовании мутационного статуса гена BRAF в объединенной группе мужчин и женщин с меланомой кожи были обнаружены следующие мутации:p.V600E(92%), характеризующаяся нуклеотидной заменойT на A в положении 1799, в результате чего происходит замена аминокислоты валина на глутаминовуюкислоту в положении 600. Мутация p.V600K (4% от общего количества мутаций), характеризующаяся заменойдвух нуклеотидов GTна AAв положении 1798-1799 и приводящая к замене аминокислоты валина на аминокислоту аспарагин в положении 600.Мутация p.V600 K601>E(4% от общего количества мутаций), характеризующаяся делецией трех нуклеотидов TGAв положении 1799-1801 и сдвигом рамки считывания.

 

Как показали результаты нашего исследования (Табл. 1), в группе пациентов с размером опухолей Т1частота встречаемости дикого типагенаBRAFстатистически достоверно была более чем в три раза выше, чем mtBRAF(p=0,0001).

В группах пациентов с размером опухолей Т3 и Т4 количество пациентов с mtBRAF было ~на 20 % больше, чем с wtBRAF (Таблица 1), что может говорить в пользу высокой скорости деления клетокBRAFассоциированной меланомы кожи[1].

Таблица 1

Зависимость размера опухоли от мутационного статуса гена BRAF

 

T1

T2

T3

T4

 

wt BRAF

 

77,8%

 

 

53,3%

 

     38,5%

 

     40%

 

mt BRAF

 

   22,2%

 

 

46,7%

 

     61,5%

 

      60%

В группе пациентов с mtBRAFна 23%чаще, чем в группе wtBRAF встречалась толщина опухоли по Бреслоу ≥ 2 мм (р=0,008).

Метастазирование в регионарные лимфатические узлы наблюдалось лишь в группе с мутацией гена BRAF и встречалось в 11,5% случаев. (Табл. 2).

Таблица 2

Характеристика мутационного статуса гена BRAF в зависимости от клинико-морфологических особенностей

Показатели

wtBRAF

mtBRAF

 

Пол

       Мужской

       Женский

 

 

58%  (n=15 )

42 % (n=11 )

 

42 % (n=11 )

58 %  (n=15 )

 

 

      Метастазы в ЛФУ

 

                Присутствуют

 

                 Отсутствуют                          

 

 

 

0 %

 

100%(n=26 )

 

 

 

 

11,5 % (n=3 )

 

88,5% (n=23)

Толщина  по Бреслоу

< 2 мм

≥ 2 мм

 

 

 

50%   ( n=13 )

 50%   ( n=13 )

 

 

 

 27% ( n=7 )

73%(n=19 )

Также в группе мутациив генеBRAFна 16%чаще встречались у женщин (р=0,023),(Табл. 2).

Заключение

Таким образом, при проведении молекулярно-генетического скринингамутаций в 15 экзоне гена BRAF(секвенирование ДНКпо Сэнгеру) у 52 больных Юга России с меланомой кожи нами установлены три варианта мутаций в 15 экзоне гена BRAF: p.V600E, p.V600Kи V600 K601>E (мутация V600 K601>E впервые диагностирована на Юге России).BRAF мутациибыли обнаружены у 50% пациентов: p.V600E в 92%, p.V600K в 4% иV600 K601>Eв4% случаев. Усредненный показатель частоты мутаций V600E в 15 экзоне гена BRAF (для мужчин и женщин) составил 47%. Наблюдалось достоверное увеличение случаев частоты соматической мутации V600E в 15 экзоне гена BRAF у пациентов с толщиной опухоли по Бреслоу ≥ 2 мм на 23%.Метастазирование в регионарные лимфатические узлы наблюдалось лишь в группе с мутацией гена BRAF и встречалось в 11,5% случаев.

 

Рецензенты:

Франциянц Е.М.,д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону;

Горошинская И.А., д.б.н.,профессор, главный научный сотрудник лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ,г. Ростов-на-Дону.