Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА УТЯТ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ

Трефилов Б.Б. 1 Леонов И.К. 1 Никитина Н.В. 1
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства»
Зависимость между rct – признаком вируса и другими генетическими маркерами, в частности, патогенностью, составляет в настоящее время сущность теоретического обоснования применения метода пассажей в культуре клеток при неоптимальных температурах для получения вирусных препаратов с измененными биологическими свойствами. Изучение и разработка критериев и методов контроля аттенуированных штаммов, используемых для производства биопрепаратов, является актуальным. В статье показана способность к репликации вакцинных штаммов ВГНКИ-К и 3М-УНИИП вируса гепатита утят и их динамика накопления в различных клеточных культурах (куриные и утиные фибробласты, клетки почки и печени утиных эмбрионов). Установлен различный индекс чувствительности клеточных культур к штаммам вируса. Показана возможность культивирования производственных вакцинных штаммов вируса гепатита утят при пониженной и повышенной температурах. Штаммы ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП характеризовались как rctTC32º ±, rctTC40º+ и rctTC32º +, rctTC40º+ соответственно.
вирус гепатита утят
культура клеток
репликация
пассажи
температура
1. Белицкая Л.А. Выращивание вируса гепатита утят в тканевых культурах/ Л.А. Белицкая // Сб. работ молодых ученых ВНИИП. – 1964. – Вып. 7. – С. 18-19.
2. Беньеш-Мельник М.Б. Маркирующие признаки вируса полиомиелита и их отношение к вирулентности штаммов вируса для обезьян / М. Беньеш-Мельник, Дж. Мельник // Полиомиелитная пероральная живая вакцина. – М., 1961. – С.210-223.
3. Бочкарев В.С. Иммунобиологические свойства вакцинных штаммов метапневмовируса птиц: автореф. дис... канд. вет. наук/ В.С. Бочкарев. – СПб., 2013. – 22 с.
4. Князев В.П. Некоторые аспекты диагностики, лечения и специфической профилактики вирусных инфекций уток: монография / В.П. Князев, О.В. Белорыбкина, С.Р. Кременчугская, Т.А. Фомина. – Владимир, 2003. – 60с.
5. Князев В.П. Болезни водоплавающих птиц: монография/ В.П. Князев. – Владимир, 2010. – 160с.
6. Майборода А.Д. Действие вируса гепатита утят на клетки тканевых культур почек цыплят и утиных эмбрионов/А.Д. Майборода // Ветеринария. – 1965. – № 8. – С. 28.
7. Майборода А.Д. Формирование вируса гепатита уток в культуре клеток/А.Д. Майборода // Ветеринария. – 1972. – № 8. – С. 50.
8. Паникар И.И. Вирусный гепатит утят и его профилактика / И.И. Паникар. – М. Россельхозиздат, 1987. – 63с.
9. Сарбаева Н.В. Сравнительная характеристика вакцинного и эпизоотических штаммов реовируса теносиновита кур: автореф. дис. … канд. биол. наук/ Н.В. Сарбаева. – М., 1997. – 23с.
10. Сюрин В.Н. Ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. – М.: Агропромиздат, 1991. – С.376.
11. Трефилов Б.Б. Сравнительное изучение генетических признаков вакцинных штаммов вируса инфекционного ларинготрахеит птиц: автореф. дис... канд. биол. наук / Б.Б. Трефилов. – Тарту, 1972. – 27с.
12. Трефилов Б.Б. Разработка и внедрение средств диагностики и специфической профилактики наиболее опасных вирусных болезней птиц (инфекционный ларинготрахеит, вирусный энтерит гусей, реовирусный теносиновит): автореф. дис... д-ра вет. наук/ Б.Б. Трефилов. – СПб., 2000. – 42с.
13. Heide L. Development of an attenuated apatogenic reovirus vaccine against viral arthritig / tenosynovitis// L. Heide, M. Kalbac, M. Brustolon. Av. Dis, 1985. – Vol.27. – No. 3. – P. 689-706.
14. Jin X. Identification and molecular analysis of the highly pathogenic duck hepatitis virus type 1 in Hubei Province of China/ X. Jin, W. Zhang, W. Zhang [et al.]// Res. Vet. Sci., 2008. – V. 85. – P. 595-598.
15. Patnayak D.P. Cold-adapted avian pneumovirus of use as live, attenuated vaccine in turkeys / D.P.Patnayak, B.R.Gulati, M.A.Sheikh [et al.] // Vaccine. – 2003. – V.21. – P..1371-1374.
16. Tseng C.H. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus/ C.H.Tseng, N.J. Knowles, H.J. Tsai // Virus Res., 2007. – V. 123. – P. 190-203.
17. Woolcock P.R. Duck hepatitis/ P.R. Woolcock , Y.M. Saif, A.M. Fadly [et al.] // In: Diseases of Poultry 12th Edition, 2008. – P. 373-384.

Вирусный гепатит утят (ВГУ) - высоко контагиозная, остро протекающая среди утят и латентно среди уток болезнь, с преимущественным поражением печени. Эта болезнь до настоящего времени имеет широкое распространение в утководческих хозяйствах промышленного типа и сопровождается высокой смертностью утят 1-30 - суточного возраста, достигая до 30-95 % [4,5,17].

Вирус гепатита утят типа I относится к семейству Picarnoviridae роду Avihepatovirus [14,16].

Вирус удается культивировать на первичных клетках печени и почки эмбрионов уток и гусей [1,6], а также на фибробластах утиного и куриного эмбрионов с коллагеназой [1,7,8].

Метод тканевых культур находит все большее применение в генетических исследованиях с вирусами животных и человека. С его помощью изучен целый ряд важных генетических признаков вирусов: цитопатогенная, бляшкообразующая, интерфероногенная активность, чувствительность к экзогенному интерферону, способность к репликации при различных температурах и другие.

Способность вирусов к репродукции и способность вызывать цитопатогенное действие в клеточных культурах, а также их репликация при различных температурах культивирования являются наследственными биологическими признаками.

Работами ряда исследователей показана возможность изменения наследственных свойств вирусов путем пассажей в культуре клеток при пониженной и повышенной температурах. Усиленное применение этого метода оказалось тесно связано с глубоким изучением способности вирусов к репликации при определенной температуре, так называемого rct - признака.

Доказано, что rct - маркер вирусов является наследственным свойством и даже отдельные штаммы одного вируса обладают не одинаковым rct - признаком [3,9, 11,12,15].

Зависимость между rct - признаком и патогенностью составляет в настоящее время сущность теоретического обоснования применения метода пассажей у культуре клеток при неоптимальных температурах для получения вирусных вакцин с измененными биологическими свойствами [13,15].

Учитывая, что в литературе слабо освещен вопрос о способности вируса гепатита утят к репликации в тех или иных видах тканевых культурах и отсутствие данных по культивированию вируса при различных температурах, целью наших исследований явилось изучение способности вакцинных штаммов вируса гепатита утят к репликации в культурах клеток при различных температурах культивирования ( TC и rct - маркеры).

Материалы и методы исследований

Вирус. В работе использовали производственные вакцинные штаммы ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП вируса гепатита утят, культивируемые в культуре утиных фибробластов при температуре 37 º С, и хранили при минус 20 º С.

Культуры клеток: культура фибробластов 10-12 - суточных куриных эмбрионов (ФЭК); культура фибробластов 14-15 - суточных утиных эмбрионов (ФЭУ); культура клеток печени 25-27 - суточных утиных эмбрионов; культура клеток почки 25-27 - суточных утиных эмбрионов.

Первично-трипсинизированную культуру клеток готовили из кожно-мышечной ткани, печени и почек куриных и утиных эмбрионов по методике Dulbecco R.&Vogt M. (1954) в модификации Younger J.S. (1954) [10].

В качестве питательной ростовой среды использовали среду Игла МЕМ/ДМЕМ и среду 199 в соотношении 2:1 с добавлением 10 % нормальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков: бензилпенициллина 100 ЕД/см3 и стрептомицина сульфата - 100 мкг/см3. Раствор для диспергирования ткани состоял из 0,25 % раствора трипсина, 0,02 % раствора версена и раствора Хенкса в соотношении 1:2:2. Трипсинизацию проводили на магнитной мешалке при температуре 36-37 ºС в течение 10-15 мин до полного расщепления фрагментов ткани на отдельные клетки. По истечении указанного времени клеточную взвесь сливали во флаконы с охлажденной смесью сыворотки крови крупного рогатого скота до 10 % и среды Игла (соотношение 1:1) с целью нейтрализации действия трипсина.

Суспензию клеток центрифугировали при 900-1000 об/мин в течение 20 мин. Из осадка после ресуспензирования готовили суспензию клеток в питательной ростовой среде с содержанием 650-750 тыс. кл./см3. Клеточную суспензию разливали в пробирки и матрасы по 2 и 220 см3 соответственно и инкубировали в стационарных условиях при температуре (37,0±0,5)º С. В течение 48 часов на поверхности стекла формировался клеточный монослой.

Определение RctTC признака. Способность вакцинных штаммов к репликации при неоптимальных температурах изучали путем 5-кратного пассирования в культуре фибробластов утиных эмбрионов. Культивирование зараженных и контрольных клеток проводили при температурах 32 и 40 ° C, учитывая время наступления и характер ЦПД в культуре клеток. Инфицирование ФЭУ проводили в дозе 1,0 ЦПД50 на клетку. После 1, 3 и 5-го пассажа определяли инфекционный титр вируса методом титрования и выражали в lg ТЦД50/см3.

RctTC признак штаммов вируса, определяли по методу М. Беньеш-Мельник и Дж.Л. Мельник (1961) [2] , в основе которого лежит вычисление разности между титрами изучаемых штаммов вируса при 37 и 32 ° C или 37 и 40 ° C. Так, rct32°- /rct40°-/ - разница титров вируса больше 4 lg ТЦД50/см3 ; rct32°+/ rct40° +/ - разница титров вируса меньше 2 lg ТЦД50/см3 ; rct32о± / rct40о±/ - разница титров вируса от 2,1 до 4 lg ТЦД50/см3 .

Титрование вируса на культуре клеток по цитопатогенному действию (ЦПД) проводили в культурах клеток методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями.

Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench H. (1938) [10] и выражали в lg ТЦД50 в 1.0 см3 (тканевая цитопатогенная доза).

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методам.

Результаты исследований и обсуждение

Вакцинные штаммы ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП вируса гепатита утят вызывали острую форму вирусной инфекции в культурах клеток куриных и утиных эмбрионов при температурах культивирования 32, 37 и 40 º С. Цитопатогенное действие сопровождалось округлением клеток на ограниченных участках монослоя, появлением симпластических образований с зернистостью в цитоплазме клеток через 72-96 часов после инокуляции, а на последней стадии репликации вируса формированием синцития и дегенерацией клеточного монослоя через 96-120 часов культивирования. Латентная фаза штамма ВГНКИ-К при температуре 37 º С составила 24 часов и 48 часов штамма ЗМ-УНИИП, а при температуре 32 и 40 º С она равнялась у штаммов ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП 72 и 48 часам соответственно. .Данные определения активности штаммов в различных первично-трипсинизированных культурах клеток при температуре 37 º С представлены в табл. 1.

Таблица 1

Биологическая активность вакцинных штаммов ВГНКИ-К и 3М-УНИИП вируса гепатита утят в культурах клеток при 37 º С

 

 

Штамм вируса

Активность штаммов, lg ТЦД50,M±m*

Культура клеток

ФЭК

ФЭУ

почки

печени

утиного эмбриона

ВГНКИ-К

 

3,75 ± 0,5

 

5,66 ± 0,3

6,00 ± 0,1

6,67 ± 0,25

ЗМ- УНИИП

3,25± 0,15

4,6± 0,25

5,00± 0,2

5,25± 0,3

Примечание: M ± m - среднее значение титров штамма вируса.

Результаты исследований показали, что вакцинные штаммы ВГНКИ-К и 3М-УНИИП вируса гепатита утят способны к репликации в фибробластах куриных и утиных эмбрионов и в культуре клеток почки и печени утиного эмбриона, вызывая в них цитопатогенное действие различной интенсивности. Установлено, что культуры клеток утиных эмбрионов были более чувствительны к штаммам вируса по сравнению с культурой фибробластов куриных эмбрионов. Активность штамма ВГНКИ-К вируса гепатита утят была выше в культурах утиного эмбриона 1-1,5 lg ТЦД50 по сравнению с активностью штамма 3М-УНИИП.

В процессе изучения культуральных свойств штаммов вируса гепатита утят была определена чувствительность различных первичных клеточных культур относительно клеток печени утиных эмбрионов, которую выражали в индексе чувствительности (И) и вычисляли по формуле: И = Т/P , где Т - обратная величина конечного разведения вируса, при котором ЦПД регистрируется в 50 % пробирок с испытуемым монослоем; Р - обратная величина конечного разведения вируса, при котором ЦПД регистрируется в 50 % пробирок с культурой клеток печени. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Чувствительность клеточных культур к вакцинным штаммам вируса гепатита утят

 

Наименование культуры клеток

Индекс чувствительности, И

Вакцинные штаммы:

ВГНКИ-К

3М-УНИИП

Клетки печени

1

1

Клетки почки

0,9

0,93

ФЭУ

0,85

0,63

ФЭК

0,56

0,65

Данные, приведенные в таблице 2, показали, что культура клеток печени утиного эмбриона наиболее чувствительна к изучаемым вакцинным штаммам вируса гепатита утят.

Способность вакцинных штаммов вируса гепатита к репликации при различной температуре изучали в процессе 5-ти пассажей в культуре фибробластов утиных эмбрионов.

Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Инфекционные титры вакцинных штаммов вируса гепатита утят при различных температурах культивирования

 

 

Пассаж

ВГНКИ-К

 

 

Пассаж

ЗМ-УНИИП

Титр вируса, lg ТЦД50/ см3

Титр вируса, lg ТЦД50/ см3

Температура культивирования

Температура культивирования

32 º С

37 º С

40 º С

32 º С

37 º С

40 º С

1

2,25±0,1

5,66±0,3

2,75±0,5

1

1,75±0,2

4,5±0,25

2,5±0,2

3

2,75±0,2

5,75±0,1

3,25±0,7

3

2,00±0,5

4,75±0,5

3,00±0,5

5

3,00±0,5

5,75±0,2

4,00±0,2

5

2,75±0,3

4,67±0,3

3,2±0,6

Данные титрации штаммов вируса свидетельствуют о том, что в процессе пассирования происходила адаптация к измененным температурным условиям культивирования, о чем констатировало повышение активности вируса с увеличением числа пассажей. Результаты определения принадлежности штаммов ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП вируса гепатита утят по rctTC - признаку представлены в табл.4.

Таблица 4

Характеристика вакцинных штаммов вируса гепатита утят по RctTC- маркеру (по 5-ому пассажу)

 

Штамм вируса

Инфекционный титр вируса, lg ТЦД50/ см3(М±m)

Температура культивирования

RctTC32º

Индекс подавления репликации вируса lg ТЦД5037º -

lgТЦД5032º

Характеристика штамма по

rct32º

RctTC37º

Характеристика штамма по

rct37º

RctTC40º

Индекс подавления репликации вируса lg ТЦД5037º -

lgТЦД5040º

Характеристика штамма по

rct40º

ВГНКИ-К

3,00±0,5

2,75±0,3

±

5,75±0,2

+

4,00±0,2

1,75±0,1

+

ЗМ-УНИИП

2,75±0,3

1,92±0,1

+

4,67±0,3

+

3,2±0,6

1,47±0,3

+

Суммируя полученные результаты, следует отметить, что вакцинные штаммы ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП вируса гепатита утят различались по способности к репликации при пониженной температуре и характеризовались как rctTC32º± и rctTC32º+ штаммы соответственно. Индексы подавления репликации их при температуре 32º С равнялись 2,75±0,3 и1,92±0,1 lg ТЦД50. В то время как при температуре 40º С степень репликации штаммов была выше и характеризовались как rctTC40º+ штаммы, их индексы подавления были

1,75±0,1 и 1,47±0,3 lg ТЦД50. Различия в цитопатогенной активности вакцинных штаммов вируса гепатита были выявлены при культивировании их в условиях пониженной температуры.

Выводы

Показана способность штаммов ВГНКИ-К и 3М-УНИИП вируса гепатита утят к репликации в первичных культурах клеток (ТС-признак). Штамм ВГНКИ-К характеризуется как TCche±, TCde±, TCNde+, TCHde+ , а 3М-УНИИП - как TCche±, TCde+, TCNde+, TCHde+ штаммы вируса.

Вакцинные штаммы вируса гепатита утят отличаются по rctTC32º - маркеру и аналогичны по rctTC40º - признаку.

Изученные маркеры свидетельствуют о слабой аттенуации вакцинных штаммов вируса гепатита утят и возможной их реверсии в процессе пассирования при производстве вакцин.

Рецензенты:

Бакулин В.А., д.вет.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», г. Санкт-Петербург;

Разбицкий В.М., д.вет.н., старший научный сотрудник отдела паразитологии, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства», г. Санкт-Петербург - Ломоносов.


Библиографическая ссылка

Трефилов Б.Б., Леонов И.К., Никитина Н.В. РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА УТЯТ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 2-2.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=22250 (дата обращения: 20.02.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074