Вирусный гепатит утят (ВГУ) - высоко контагиозная, остро протекающая среди утят и латентно среди уток болезнь, с преимущественным поражением печени. Эта болезнь до настоящего времени имеет широкое распространение в утководческих хозяйствах промышленного типа и сопровождается высокой смертностью утят 1-30 - суточного возраста, достигая до 30-95 % [4,5,17].
Вирус гепатита утят типа I относится к семейству Picarnoviridae роду Avihepatovirus [14,16].
Вирус удается культивировать на первичных клетках печени и почки эмбрионов уток и гусей [1,6], а также на фибробластах утиного и куриного эмбрионов с коллагеназой [1,7,8].
Метод тканевых культур находит все большее применение в генетических исследованиях с вирусами животных и человека. С его помощью изучен целый ряд важных генетических признаков вирусов: цитопатогенная, бляшкообразующая, интерфероногенная активность, чувствительность к экзогенному интерферону, способность к репликации при различных температурах и другие.
Способность вирусов к репродукции и способность вызывать цитопатогенное действие в клеточных культурах, а также их репликация при различных температурах культивирования являются наследственными биологическими признаками.
Работами ряда исследователей показана возможность изменения наследственных свойств вирусов путем пассажей в культуре клеток при пониженной и повышенной температурах. Усиленное применение этого метода оказалось тесно связано с глубоким изучением способности вирусов к репликации при определенной температуре, так называемого rct - признака.
Доказано, что rct - маркер вирусов является наследственным свойством и даже отдельные штаммы одного вируса обладают не одинаковым rct - признаком [3,9, 11,12,15].
Зависимость между rct - признаком и патогенностью составляет в настоящее время сущность теоретического обоснования применения метода пассажей у культуре клеток при неоптимальных температурах для получения вирусных вакцин с измененными биологическими свойствами [13,15].
Учитывая, что в литературе слабо освещен вопрос о способности вируса гепатита утят к репликации в тех или иных видах тканевых культурах и отсутствие данных по культивированию вируса при различных температурах, целью наших исследований явилось изучение способности вакцинных штаммов вируса гепатита утят к репликации в культурах клеток при различных температурах культивирования ( TC и rct - маркеры).
Материалы и методы исследований
Вирус. В работе использовали производственные вакцинные штаммы ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП вируса гепатита утят, культивируемые в культуре утиных фибробластов при температуре 37 º С, и хранили при минус 20 º С.
Культуры клеток: культура фибробластов 10-12 - суточных куриных эмбрионов (ФЭК); культура фибробластов 14-15 - суточных утиных эмбрионов (ФЭУ); культура клеток печени 25-27 - суточных утиных эмбрионов; культура клеток почки 25-27 - суточных утиных эмбрионов.
Первично-трипсинизированную культуру клеток готовили из кожно-мышечной ткани, печени и почек куриных и утиных эмбрионов по методике Dulbecco R.&Vogt M. (1954) в модификации Younger J.S. (1954) [10].
В качестве питательной ростовой среды использовали среду Игла МЕМ/ДМЕМ и среду 199 в соотношении 2:1 с добавлением 10 % нормальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков: бензилпенициллина 100 ЕД/см3 и стрептомицина сульфата - 100 мкг/см3. Раствор для диспергирования ткани состоял из 0,25 % раствора трипсина, 0,02 % раствора версена и раствора Хенкса в соотношении 1:2:2. Трипсинизацию проводили на магнитной мешалке при температуре 36-37 ºС в течение 10-15 мин до полного расщепления фрагментов ткани на отдельные клетки. По истечении указанного времени клеточную взвесь сливали во флаконы с охлажденной смесью сыворотки крови крупного рогатого скота до 10 % и среды Игла (соотношение 1:1) с целью нейтрализации действия трипсина.
Суспензию клеток центрифугировали при 900-1000 об/мин в течение 20 мин. Из осадка после ресуспензирования готовили суспензию клеток в питательной ростовой среде с содержанием 650-750 тыс. кл./см3. Клеточную суспензию разливали в пробирки и матрасы по 2 и 220 см3 соответственно и инкубировали в стационарных условиях при температуре (37,0±0,5)º С. В течение 48 часов на поверхности стекла формировался клеточный монослой.
Определение RctTC признака. Способность вакцинных штаммов к репликации при неоптимальных температурах изучали путем 5-кратного пассирования в культуре фибробластов утиных эмбрионов. Культивирование зараженных и контрольных клеток проводили при температурах 32 и 40 ° C, учитывая время наступления и характер ЦПД в культуре клеток. Инфицирование ФЭУ проводили в дозе 1,0 ЦПД50 на клетку. После 1, 3 и 5-го пассажа определяли инфекционный титр вируса методом титрования и выражали в lg ТЦД50/см3.
RctTC признак штаммов вируса, определяли по методу М. Беньеш-Мельник и Дж.Л. Мельник (1961) [2] , в основе которого лежит вычисление разности между титрами изучаемых штаммов вируса при 37 и 32 ° C или 37 и 40 ° C. Так, rct32°- /rct40°-/ - разница титров вируса больше 4 lg ТЦД50/см3 ; rct32°+/ rct40° +/ - разница титров вируса меньше 2 lg ТЦД50/см3 ; rct32о± / rct40о±/ - разница титров вируса от 2,1 до 4 lg ТЦД50/см3 .
Титрование вируса на культуре клеток по цитопатогенному действию (ЦПД) проводили в культурах клеток методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями.
Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench H. (1938) [10] и выражали в lg ТЦД50 в 1.0 см3 (тканевая цитопатогенная доза).
Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методам.
Результаты исследований и обсуждение
Вакцинные штаммы ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП вируса гепатита утят вызывали острую форму вирусной инфекции в культурах клеток куриных и утиных эмбрионов при температурах культивирования 32, 37 и 40 º С. Цитопатогенное действие сопровождалось округлением клеток на ограниченных участках монослоя, появлением симпластических образований с зернистостью в цитоплазме клеток через 72-96 часов после инокуляции, а на последней стадии репликации вируса формированием синцития и дегенерацией клеточного монослоя через 96-120 часов культивирования. Латентная фаза штамма ВГНКИ-К при температуре 37 º С составила 24 часов и 48 часов штамма ЗМ-УНИИП, а при температуре 32 и 40 º С она равнялась у штаммов ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП 72 и 48 часам соответственно. .Данные определения активности штаммов в различных первично-трипсинизированных культурах клеток при температуре 37 º С представлены в табл. 1.
Таблица 1
Биологическая активность вакцинных штаммов ВГНКИ-К и 3М-УНИИП вируса гепатита утят в культурах клеток при 37 º С
|
Штамм вируса |
Активность штаммов, lg ТЦД50,M±m* |
|||
|
Культура клеток |
||||
|
ФЭК |
ФЭУ |
почки |
печени |
|
|
утиного эмбриона |
||||
|
ВГНКИ-К |
3,75 ± 0,5 |
5,66 ± 0,3 |
6,00 ± 0,1 |
6,67 ± 0,25 |
|
ЗМ- УНИИП |
3,25± 0,15 |
4,6± 0,25 |
5,00± 0,2 |
5,25± 0,3 |
Примечание: M ± m - среднее значение титров штамма вируса.
Результаты исследований показали, что вакцинные штаммы ВГНКИ-К и 3М-УНИИП вируса гепатита утят способны к репликации в фибробластах куриных и утиных эмбрионов и в культуре клеток почки и печени утиного эмбриона, вызывая в них цитопатогенное действие различной интенсивности. Установлено, что культуры клеток утиных эмбрионов были более чувствительны к штаммам вируса по сравнению с культурой фибробластов куриных эмбрионов. Активность штамма ВГНКИ-К вируса гепатита утят была выше в культурах утиного эмбриона 1-1,5 lg ТЦД50 по сравнению с активностью штамма 3М-УНИИП.
В процессе изучения культуральных свойств штаммов вируса гепатита утят была определена чувствительность различных первичных клеточных культур относительно клеток печени утиных эмбрионов, которую выражали в индексе чувствительности (И) и вычисляли по формуле: И = Т/P , где Т - обратная величина конечного разведения вируса, при котором ЦПД регистрируется в 50 % пробирок с испытуемым монослоем; Р - обратная величина конечного разведения вируса, при котором ЦПД регистрируется в 50 % пробирок с культурой клеток печени. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
Чувствительность клеточных культур к вакцинным штаммам вируса гепатита утят
|
Наименование культуры клеток |
Индекс чувствительности, И |
|
|
Вакцинные штаммы: |
||
|
ВГНКИ-К |
3М-УНИИП |
|
|
Клетки печени |
1 |
1 |
|
Клетки почки |
0,9 |
0,93 |
|
ФЭУ |
0,85 |
0,63 |
|
ФЭК |
0,56 |
0,65 |
Данные, приведенные в таблице 2, показали, что культура клеток печени утиного эмбриона наиболее чувствительна к изучаемым вакцинным штаммам вируса гепатита утят.
Способность вакцинных штаммов вируса гепатита к репликации при различной температуре изучали в процессе 5-ти пассажей в культуре фибробластов утиных эмбрионов.
Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3
Инфекционные титры вакцинных штаммов вируса гепатита утят при различных температурах культивирования
|
Пассаж |
ВГНКИ-К |
Пассаж |
ЗМ-УНИИП |
||||
|
Титр вируса, lg ТЦД50/ см3 |
Титр вируса, lg ТЦД50/ см3 |
||||||
|
Температура культивирования |
Температура культивирования |
||||||
|
32 º С |
37 º С |
40 º С |
32 º С |
37 º С |
40 º С |
||
|
1 |
2,25±0,1 |
5,66±0,3 |
2,75±0,5 |
1 |
1,75±0,2 |
4,5±0,25 |
2,5±0,2 |
|
3 |
2,75±0,2 |
5,75±0,1 |
3,25±0,7 |
3 |
2,00±0,5 |
4,75±0,5 |
3,00±0,5 |
|
5 |
3,00±0,5 |
5,75±0,2 |
4,00±0,2 |
5 |
2,75±0,3 |
4,67±0,3 |
3,2±0,6 |
Данные титрации штаммов вируса свидетельствуют о том, что в процессе пассирования происходила адаптация к измененным температурным условиям культивирования, о чем констатировало повышение активности вируса с увеличением числа пассажей. Результаты определения принадлежности штаммов ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП вируса гепатита утят по rctTC - признаку представлены в табл.4.
Таблица 4
Характеристика вакцинных штаммов вируса гепатита утят по RctTC- маркеру (по 5-ому пассажу)
|
Штамм вируса |
Инфекционный титр вируса, lg ТЦД50/ см3(М±m) |
|||||||
|
Температура культивирования |
||||||||
|
RctTC32º |
Индекс подавления репликации вируса lg ТЦД5037º - lgТЦД5032º |
Характеристика штамма по rct32º |
RctTC37º |
Характеристика штамма по rct37º |
RctTC40º |
Индекс подавления репликации вируса lg ТЦД5037º - lgТЦД5040º |
Характеристика штамма по rct40º |
|
|
ВГНКИ-К |
3,00±0,5 |
2,75±0,3 |
± |
5,75±0,2 |
+ |
4,00±0,2 |
1,75±0,1 |
+ |
|
ЗМ-УНИИП |
2,75±0,3 |
1,92±0,1 |
+ |
4,67±0,3 |
+ |
3,2±0,6 |
1,47±0,3 |
+ |
Суммируя полученные результаты, следует отметить, что вакцинные штаммы ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП вируса гепатита утят различались по способности к репликации при пониженной температуре и характеризовались как rctTC32º± и rctTC32º+ штаммы соответственно. Индексы подавления репликации их при температуре 32º С равнялись 2,75±0,3 и1,92±0,1 lg ТЦД50. В то время как при температуре 40º С степень репликации штаммов была выше и характеризовались как rctTC40º+ штаммы, их индексы подавления были
1,75±0,1 и 1,47±0,3 lg ТЦД50. Различия в цитопатогенной активности вакцинных штаммов вируса гепатита были выявлены при культивировании их в условиях пониженной температуры.
Выводы
Показана способность штаммов ВГНКИ-К и 3М-УНИИП вируса гепатита утят к репликации в первичных культурах клеток (ТС-признак). Штамм ВГНКИ-К характеризуется как TCche±, TCde±, TCNde+, TCHde+ , а 3М-УНИИП - как TCche±, TCde+, TCNde+, TCHde+ штаммы вируса.
Вакцинные штаммы вируса гепатита утят отличаются по rctTC32º - маркеру и аналогичны по rctTC40º - признаку.
Изученные маркеры свидетельствуют о слабой аттенуации вакцинных штаммов вируса гепатита утят и возможной их реверсии в процессе пассирования при производстве вакцин.
Рецензенты:
Бакулин В.А., д.вет.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», г. Санкт-Петербург;
Разбицкий В.М., д.вет.н., старший научный сотрудник отдела паразитологии, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства», г. Санкт-Петербург - Ломоносов.