Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Болезнь Крона (БК) - гранулематозное воспаление пищеварительного тракта неизвестной этиологии с преимущественной локализацией в терминальном отделе подвздошной кишки, характеризующееся формированием стенозов пораженных участков кишки, образованием свищей, внекишечными проявлениями, сопровождающееся рецидивирующим течением с длительной временной, нередко стойкой нетрудоспособностью и инвалидизацией трудоспособного населения [1, 2, 4]. Согласно последним эпидемиологическим исследованиям, наиболее высокие показатели заболеваемости зарегистрированы в Европе (12,7 на 100000 населения) и в Северной Америке (20,2 на 100000 человек-лет) [2, 4].

Неясная этиология, сложные и не полностью изученные механизмы патогенеза диктуют необходимость дальнейшего изучения указанной патологии. На сегодняшний день не вызывает сомнения полиэтиологичность БК, с акцентом на генетические вариации, аберрации врожденного и адаптивного иммунного ответа, подкрепляемые влиянием качественных и количественных изменений состава кишечной микробиоты и факторов окружающей среды [4]. В настоящее время принципиально важная роль в этиопатогенезе отводится факторам врожденного иммунитета, образраспознающим рецепторам эпителиальных и иммунокомпетентных клеток, в частности Toll-подобным рецепторам (TLR - Toll-likereceptors) [4, 7]. Способность TLR распознавать TLR сигнальные компоненты, к которым относятся компоненты стенки микробной клетки, сопровождается активацией сигнальных путей, что приводит к созреванию дендритных клеток, продукции цитокинов и запуску адаптивного иммунного ответа [6]. Существует мнение, что в случае нарушения в системе врожденного иммунного ответа гиперактивация TLRs эндогенными лигандами бактерий может быть одним из основных механизмов реактивации хронического воспаления в пораженном сегменте кишки, что закономерно приводит к раннему рецидиву БК [7]. Более того, по мнению Abad C. и соавт. именно нарушения врожденного иммунного ответа играют ключевую роль в патогенезе БК [3].

В зарубежной литературе представлен ряд работ, посвященных изучению TLR у больных с БК. Экспертиза образцов ткани из пораженных участков кишки пациентов выявило повышенное количество TLR 4-экспрессирующих клеток и увеличение экспрессии TLR4мРНК. Несколько независимых исследований подтвердили, что полиморфизм TLR4 связан с БК [7]. Липопролисахариды, являющиеся основным компонентом наружной мембраны грамотрицательных бактерий, способствуют активации TLR4, что сопровождается усилением продукции провоспалительных цитокинов и / или интерферона β [10]. В то же время, некоторые экспериментальные исследования, посвященные изучению других представителей TLRs, показали, что, например, TLR5, взаимодействующий с бактериальным флагеллином или TLR2, вступающий в тесный контакт с липопротеинами грамположительных бактерий, не связаны с прогрессированием болезни Крона [8, 9]. Малочисленные данные о факторах врожденного иммунитета при БК обусловливают перспективность изучения указанного направления при этом заболевании.

Целью данного исследования явилось динамическое определение TLR 2,4,6 у больных с БК в период рецидива и ремиссии заболевания с оценкой возможности их использования в качестве маркеров достижения ремиссии.

Материалы и методы: в исследование включено 19 пациентов с верифицированным диагнозом БК (16 - женщин, 3 - мужчин), средний возраст составил 39,3±2,7 лет. В зависимости от локализации воспалительного процесса в пищеварительной трубке пациенты распределены на 2 группы: 1 группа - 6 (31,6 %) больных с локализацией БК в толстой кишке и 2 группа - 13 (68,4 %) больных с сочетанным поражением толстой и тонкой кишок. Группу контроля составили 20 практически здоровых добровольцев (15 - женщин, 5 - мужчин) в возрасте от 19 до 51 года (средний возраст 26,2±8,3 лет).

Диагноз БК был верифицирован с использованием клинико-лабораторных, иммунологических, эндоскопических и морфологических показателей. Степень активности БК оценивалась с использованием балльного индекса Беста (CDAI) [5]. Оценка дисбиотических нарушений микробиоты толстой кишки проводилась в соответствии с положениями отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» [Пр. МЗ РФ от 09.06.2003 № 231].

Экспрессия TLR на моноцитах периферической крови определялась в иммунофлюоресцентном тесте с оценкой процента моноцитов (CD14+ -клеток), несущих на своей поверхности TLR 2,4,6. Для этого проводили поверхностное окрашивание клеток моноклональными антителами (МкАТ), конъюгированными с фикоэритрином (РЕ), к маркеру моноцитов CD14 (BeckmanCoulter, США) и мышиными моноклональными антителами к TLR2 (СD14⁺CD282⁺), TLR4 (СD14⁺CD284+) и TLR6 (СD14⁺CD286+), конъюгированными с FITC (изотиоцианатфлуоресцеина) и мечеными PE (фикоэритрин) (HyCultbiotechnology, Голландия). В исследовании также использовали соответствующие изотипические контроли, подготовленные аналогичным образом. Двухцветный анализ проводили на проточном лазерном цитофлюориметре CytomicsFC500 (BeckmanCoulter, США). Экспрессию TLR 2,4,6 и подсчет моноцитов экспрессирующих СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ определяли в фазу рецидива и медикаментозно индуцированной клинической ремиссии заболевания. На фоне двенадцатинедельной комбинированной базисной терапии фазы клинической ремиссии достигли 5 (26,3 %) больных с БК: 3 (50 %) пациента и 2 (15,4 %) пациента 1 и 2 групп наблюдения соответственно.

Результаты и обсуждение

Для оценки степени тяжести БК использовался индекс Беста, включающий частоту жидкого и кашицеобразного стула в сутки, боль в животе, общее самочувствие, количество осложнений, прием опиатов, наличие инфильтрата в брюшной полости, уровень гематокрита, масса тела больного [5]. В зависимости от тяжести рецидива все больные с БК были распределены на две подгруппы: 6 (31,6 %) пациентов со средней степенью активности и 13 (68,4 %) с высокой степенью тяжести (табл. 1).

Таблица 1.

Характеристика тяжести БК у больных с учетом индекса Беста

Согласно современным представлениям, TLR являются центральным элементом многоуровневой системы распознавания, возбуждение которых сопровождается активацией регуляторных компонентов воспалительного процесса и врожденных механизмов защиты от инфекционных агентов [3]. Мы предполагаем, что это может проявляться увеличением количества моноцитов, экспрессирующих на своей поверхности СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+.

Таблица 2

Экспрессия СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ у больныхс БК в зависимости от локализации и степени воспалительного процесса

Примечание: *- p<0,05 в сравнении с группой контроля, ** - p<0,05 в сравнении с группами в период рецидива заболевания.

Как следует из данных, представленных в таблице 2, изменение экспрессии СD14+CD282+ по сравнению с показателями группы контроля было наименьшим. Так, статистически значимое увеличение на 14,7 % и 20,3 % было зарегистрировано лишь в группе больных с поражением толстой и тонкой кишок, при среднетяжелом и тяжелом течении заболевания. Уровень TLR4 СD14+CD284+ изменялся в большей степени. Так, при поражении толстой кишки средней степени активности и тяжелом течении зарегистрировано увеличение количества моноцитов СD14+CD284+ в 2,2 раза и в 2,7 раза соответственно. При сочетанном поражении толстой и тонкой кишок в аналогичных по степени тяжести группах, количество моноцитов, экспрессирующих TLR4, увеличилось в 3,2 и 4,3 раза. Увеличение уровня TLR6СD14+CD286+ в 2,3 и 2,6 раза констатировано при средне-тяжелом и тяжелом течении БК при сочетанной локализации воспалительного процесса (p<0,05).

При достижении медикаментозно индуцированной ремиссии заболевания регистрировалось статистически достоверное снижение экспрессии СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ до значений уровней в группе контроля, что может свидетельствовать о тенденции к нормализации врожденного иммунного ответа (р>0,05).

На следующем этапе настоящего исследования нами был проведен внутригрупповой анализ между показателями экспрессии TLR у больных с рецидивом БК, в зависимости от распространённости воспалительного процесса в кишечной стенке.

Как следует из данных, представленных в таблице 3, зарегистрировано наличие сопряженности между увеличением экспрессии TLR и распространенностью воспалительного процесса. Так, при изолированном поражении толстой кишки экспрессия TLR 2 СD14+CD282+ в 1,1 и 1,2 раза превышала значение группы контроля.

Таблица 3

Экспрессия СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ у больных БК в зависимости от распространенности воспалительного процесса

Примечание: * - p<0,05в сравнении с группой контроля.

Увеличение экспрессии TLR6 СD14⁺CD286⁺ на поверхности моноцитов было более значимой: констатировано увеличение в 1,6 раз и в 2,5 раза в 1 и 2 группах по сравнению с показателями группы контроля. Максимальное увеличение TLR6 СD14+CD284+в 2,5 и 3,5 раза зарегистрированов 1 и 2 группах наблюдения (p<0,005).

Таблица 4

Экспрессия СD14⁺CD282⁺, СD14⁺CD284⁺, СD14⁺CD286⁺ в зависимости от длительности заболевания

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой контроля.

Учитывая выявленную закономерность, нами был проведен внутригрупповой анализ между показателями экспрессии TLR 2, 4, 6 и длительности БК. Результаты, представленные в таблице 4, наглядно демонстрируют однонаправленные изменения экспрессии TLR2 СD14⁺CD282⁺, TLR 4 СD14⁺CD284⁺ и TLR 6 4СD14⁺CD286⁺ у больных с БК в зависимости от длительности заболевания. Уровень моноцитов СD14⁺CD282⁺ и СD14⁺CD286⁺ у больных с впервые выявленным заболеванием и при длительности болезни до 1 года составил 75,3±4,7 % и 3,1±1,5 % и практически не отличался от значений группы контроля (р>0,05). Тенденция к увеличению количества моноцитовв 1,2 и в 2 раза зарегистрирована в диапазоне длительности болезни от 1-10 лет и более 10 лет (р<0,05). Максимальное увеличение TLR 2 и 6 зафиксировано при длительности БК более 10 лет: 83,1±2,1 % и 8,9±1,1 % соответственно, что превышало значения в группе контроля в 1,2 и 2,6 раза соответственно (р<0,05). При оценке прироста моноцитов, отражающих экспрессию TLR4, зарегистрирована аналогичная динамика изменений. Так, у больных с впервые выявленным заболеванием увеличение CD14+CD284⁺ превышало значения группы контроля в 2 раза, а при длительности заболевания более 10 лет, количество моноцитов составило 15,8±2,1 %, что в 4,3 раза превышало контрольные значения (р<0,05).

Учитывая выявленную зависимость между количеством моноцитов, экспрессирующих TLR2 СD14⁺CD282⁺, TLR4 СD14⁺CD284⁺ и TLR6 4СD14⁺CD286⁺, длительностью и активностью БК, был проведен корреляционный анализ. Результаты демонстрируют наличие прямой корреляции между экспрессией СD14⁺CD282⁺, СD14⁺CD284⁺, СD14⁺CD286⁺ и частотой дефекации (r=039,r=0,47, r=0,45 соответственно, при р<0,05), наличием патологических примесей в кале (r=0,64, r=0,55, r=0,60, при p<0,05), интенсивностью абдоминального болевого синдрома (r=0,72, r=0,57, r=0,60 соответственно, при p<0,05).

В настоящее время не утратила своего значения инфекционная теория возникновения ВЗК. В клинических исследованиях установлено, что у большинства больных с БК в период обострения заболевания регистрировались нарушениями микробиоты в виде изменения количественного и качественного состава микрофлоры кишечника. Результаты немногочисленных клинических исследований свидетельствуют о наличии при ВЗК детерминированной реакции иммунной системы на собственную микрофлору кишечника [8, 10].

Данные, представленные в таблице 5, демонстрируют наличие дисбиотических нарушений у всех больных в период рецидива заболевания. При достижении клинической ремиссии нарушения микробиоты толстой кишки зарегистрированы лишь 4 (21 %) случаях и характеризовались уменьшением количества бифидобактерий до 10⁷-10⁶ (КОЕ/г) илактобактерий до 10⁵-10⁴ (КОЕ/г). При проведении внутригруппового анализа между уровнем моноцитов CD14⁺CD282⁺, CD14⁺CD284⁺, CD14⁺CD286⁺ и степенью дисбиотических изменений толстой кишки зарегистрировано наличие прямой зависимости (p<0,005). Так, количество CD14⁺CD284⁺иCD14⁺CD286⁺ при III степени дисбиотических расстройств составило 13,1±0,7 % и 10,2±0,7 %, что превышало уровень моноцитов у больных с I степенью в 1,7 и 1,5 раза. Зарегистрированные изменения позволяю высказать предположение о наличии реакции TLR4 и 6 с собственной измененной микробиотой толстой кишки.

Таблица 5

Показатели экспрессии CD14⁺CD282⁺, CD14⁺CD284⁺, CD14⁺CD286⁺ у больных БК, имеющих нарушения в составе микрофлоры кишечника

Выводы:

1. У больных с рецидивом БК выявлено увеличение количества моноцитов в периферической крови, ответственных за экспрессию CD14⁺CD282⁺, CD14⁺CD284⁺, CD14⁺CD286⁺.
2. Увеличение экспрессии CD14⁺CD282⁺, CD14⁺CD284⁺, CD14⁺CD286⁺ находится в прямой зависимости от фазы воспалительного процесса и длительности БК. При достижении медикаментозно индуцированной клинической ремиссии заболевания регистрируется статистически достоверное снижение количества моноцитов, экспрессирующих CD14⁺CD282⁺, CD14⁺CD284⁺, CD14⁺CD286⁺.
3. Зарегистрировано наличие прямой зависимости между увеличением экспрессии CD14⁺CD284⁺ и CD14⁺CD286⁺ и степенью дисбиотических нарушений толстой кишки в периодрецидива БК.
4. Выявлена достоверная прямая корреляционная связь между уровнем моноцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD14⁺CD282⁺, CD14⁺CD284⁺, CD14⁺CD286⁺ и клиническими маркерами рецидива БК.
5. Снижение экспрессии CD14⁺CD282⁺, CD14⁺CD284⁺, CD14⁺CD286⁺ на фоне базисной терапии БК может являться интегральным показателем отражающим достижение клинической ремиссии заболевания.

Рецензенты:

Погорелова Т. Н., д-р биол. наук, профессор, зав. отделом медико-биологических проблем ФГБУ «РНИИАП» Минздравсоцразвития России, г. Ростов-на-Дону.

Яковлев А. А., д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой гастроэнтерологии и эндоскопии с курсом клинической фармакологии ФПК и ППС РостГМУ, г. Ростов-на-Дону.