Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ОЦЕНКА ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В РАЗНЫЕ ФАЗЫ ТЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ КРОНА

Мамедова Л.Н. 1
1 ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России
Обсуждается роль образраспознающих рецепторов в патогенетических механизмах болезни Крона. Проведена динамическая оценка экспрессии TLR 2,4,6 на моноцитах крови при БК в разные фазы ее течения. Учитывалось изменение экспрессии TLR 2,4,6 в период ремиссии и обострения БК, при различных степенях тяжести, оцениваемых согласно индексу Беста, различной протяженности воспалительного процесса и длительности анамнеза болезни, оценивался микробный пейзаж кишечника. Получены данные о достоверном увеличении количества моноцитов, экспрессирующихTLR 2,4,6, в период рецидива БК, изменении их количества в зависимости от степени тяжести и продолжительности заболевания, а также при нарушении состава микрофлоры кишечника. Выявлена достоверная связь между уровнем моноцитов, экспрессирующих на своей поверхности TLR 2,4,6 и клиническими маркерами рецидива БК.
6
4
TLR 2
врожденный иммунитет
клиническая ремиссия
болезнь Крона
1. Гастроэнтерология. Национальное руководство / под ред. В. Т. Ивашкина, Т. Л. Лапиной. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2011. - 480 с.
2. Халиф И. Л. Воспалительные заболевания кишечника (неспецифический язвенный колит и болезнь Крона) клиника, диагностика, лечение. - М.: Миклош, 2004. - 88 с.
3. Abad C. et al. Association of Toll-like receptor 10 and susceptibility to Crohn's disease independent of NOD2 // Nature. Genes and Immunity. - 2011. - Vol. 12. - P. 635-642
4. Baumgart D. C., Sandborn W. J. Crohn's disease // Lancet. - 2012. - Vol. 380 (9853). - P. 1590-605
5. Best W., Bectel J., Singleton et al. Development of a Crohne's disease activity index. National cooperation Crohne's Disease Study // Gastroenterology. - 1976. - Vol. 70. - P. 439-444
6. Frolkis A. et al. Environment and the inflammatory bowel diseases // Can. J. Gastroenterol. - 2013. - Vol. 27(3). - P. 18-24.
7. Hume G. E. etal. Novel NOD2 haplotype strengthens the association between TLR4 Asp299gly and Crohn's disease in an Australian population // Inflamm. Bowel Dis. - 2008. - Vol. 14. - P. 585-590.
8. Kumar H., Kawai T., Akira S. Toll-like receptors and innate immunity // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2009. - Vol. 388 (4). - P. 621-5.
9. Molodecky N. A. et al. Increasing incidence and prevalence of the inflammatory bowel diseases with time, based on systematic review // Gastroenterology. - 2012. - Vol. 142 (1). - P. 46-54.
10. Si Ming Man et al. The role of bacteria and pattern-recognition receptors in Crohn's disease // Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. - 2011. - Vol. 8. - P. 152-168.

Болезнь Крона (БК) - гранулематозное воспаление пищеварительного тракта неизвестной этиологии с преимущественной локализацией в терминальном отделе подвздошной кишки, характеризующееся формированием стенозов пораженных участков кишки, образованием свищей, внекишечными проявлениями, сопровождающееся рецидивирующим течением с длительной временной, нередко стойкой нетрудоспособностью и инвалидизацией трудоспособного населения [1, 2, 4]. Согласно последним эпидемиологическим исследованиям, наиболее высокие показатели заболеваемости зарегистрированы в Европе (12,7 на 100000 населения) и в Северной Америке (20,2 на 100000 человек-лет) [2, 4].

Неясная этиология, сложные и не полностью изученные механизмы патогенеза диктуют необходимость дальнейшего изучения указанной патологии. На сегодняшний день не вызывает сомнения полиэтиологичность БК, с акцентом на генетические вариации, аберрации врожденного и адаптивного иммунного ответа, подкрепляемые влиянием качественных и количественных изменений состава кишечной микробиоты и факторов окружающей среды [4]. В настоящее время принципиально важная роль в этиопатогенезе отводится факторам врожденного иммунитета, образраспознающим рецепторам эпителиальных и иммунокомпетентных клеток, в частности Toll-подобным рецепторам (TLR - Toll-likereceptors) [4, 7]. Способность TLR распознавать TLR сигнальные компоненты, к которым относятся компоненты стенки микробной клетки, сопровождается активацией сигнальных путей, что приводит к созреванию дендритных клеток, продукции цитокинов и запуску адаптивного иммунного ответа [6]. Существует мнение, что в случае нарушения в системе врожденного иммунного ответа гиперактивация TLRs эндогенными лигандами бактерий может быть одним из основных механизмов реактивации хронического воспаления в пораженном сегменте кишки, что закономерно приводит к раннему рецидиву БК [7]. Более того, по мнению Abad C. и соавт. именно нарушения врожденного иммунного ответа играют ключевую роль в патогенезе БК [3].

В зарубежной литературе представлен ряд работ, посвященных изучению TLR у больных с БК. Экспертиза образцов ткани из пораженных участков кишки пациентов выявило повышенное количество TLR 4-экспрессирующих клеток и увеличение экспрессии TLR4мРНК. Несколько независимых исследований подтвердили, что полиморфизм TLR4 связан с БК [7]. Липопролисахариды, являющиеся основным компонентом наружной мембраны грамотрицательных бактерий, способствуют активации TLR4, что сопровождается усилением продукции провоспалительных цитокинов и / или интерферона β [10]. В то же время, некоторые экспериментальные исследования, посвященные изучению других представителей TLRs, показали, что, например, TLR5, взаимодействующий с бактериальным флагеллином или TLR2, вступающий в тесный контакт с липопротеинами грамположительных бактерий, не связаны с прогрессированием болезни Крона [8, 9]. Малочисленные данные о факторах врожденного иммунитета при БК обусловливают перспективность изучения указанного направления при этом заболевании.

Целью данного исследования явилось динамическое определение TLR 2,4,6 у больных с БК в период рецидива и ремиссии заболевания с оценкой возможности их использования в качестве маркеров достижения ремиссии.

Материалы и методы: в исследование включено 19 пациентов с верифицированным диагнозом БК (16 - женщин, 3 - мужчин), средний возраст составил 39,3±2,7 лет. В зависимости от локализации воспалительного процесса в пищеварительной трубке пациенты распределены на 2 группы: 1 группа - 6 (31,6 %) больных с локализацией БК в толстой кишке и 2 группа - 13 (68,4 %) больных с сочетанным поражением толстой и тонкой кишок. Группу контроля составили 20 практически здоровых добровольцев (15 - женщин, 5 - мужчин) в возрасте от 19 до 51 года (средний возраст 26,2±8,3 лет).

Диагноз БК был верифицирован с использованием клинико-лабораторных, иммунологических, эндоскопических и морфологических показателей. Степень активности БК оценивалась с использованием балльного индекса Беста (CDAI) [5]. Оценка дисбиотических нарушений микробиоты толстой кишки проводилась в соответствии с положениями отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» [Пр. МЗ РФ от 09.06.2003 № 231].

Экспрессия TLR на моноцитах периферической крови определялась в иммунофлюоресцентном тесте с оценкой процента моноцитов (CD14+ -клеток), несущих на своей поверхности TLR 2,4,6. Для этого проводили поверхностное окрашивание клеток моноклональными антителами (МкАТ), конъюгированными с фикоэритрином (РЕ), к маркеру моноцитов CD14 (BeckmanCoulter, США) и мышиными моноклональными антителами к TLR2 (СD14+CD282+), TLR4 (СD14+CD284+) и TLR6 (СD14+CD286+), конъюгированными с FITC (изотиоцианатфлуоресцеина) и мечеными PE (фикоэритрин) (HyCultbiotechnology, Голландия). В исследовании также использовали соответствующие изотипические контроли, подготовленные аналогичным образом. Двухцветный анализ проводили на проточном лазерном цитофлюориметре CytomicsFC500 (BeckmanCoulter, США). Экспрессию TLR 2,4,6 и подсчет моноцитов экспрессирующих СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ определяли в фазу рецидива и медикаментозно индуцированной клинической ремиссии заболевания. На фоне двенадцатинедельной комбинированной базисной терапии фазы клинической ремиссии достигли 5 (26,3 %) больных с БК: 3 (50 %) пациента и 2 (15,4 %) пациента 1 и 2 групп наблюдения соответственно.

Результаты и обсуждение

Для оценки степени тяжести БК использовался индекс Беста, включающий частоту жидкого и кашицеобразного стула в сутки, боль в животе, общее самочувствие, количество осложнений, прием опиатов, наличие инфильтрата в брюшной полости, уровень гематокрита, масса тела больного [5]. В зависимости от тяжести рецидива все больные с БК были распределены на две подгруппы: 6 (31,6 %) пациентов со средней степенью активности и 13 (68,4 %) с высокой степенью тяжести (табл. 1).

Таблица 1.

Характеристика тяжести БК у больных с учетом индекса Беста

Степень тяжести

Количество баллов

Локализация воспалительного процесса

Общее количество больных (%)

1 группа

2 группа

количество больных, %

Легкая

150-300

_

_

_

Средняя

300-450

4 (21,1 %)

2 (10,5 %)

6 (31,6 %)

Тяжелая

>450

2 (10,5 %)

11 (57,9 %)

13 (68,4 %)

Согласно современным представлениям, TLR являются центральным элементом многоуровневой системы распознавания, возбуждение которых сопровождается активацией регуляторных компонентов воспалительного процесса и врожденных механизмов защиты от инфекционных агентов [3]. Мы предполагаем, что это может проявляться увеличением количества моноцитов, экспрессирующих на своей поверхности СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+.

Таблица 2

Экспрессия СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ у больныхс БК в зависимости от локализации и степени воспалительного процесса

Фаза

Рецидив

Ремиссия

контроль

Локализация

группа 1

группа 2

группа 1

группа 2

 

Степень тяжести

средняя

тяжелая

средняя

тяжелая

средняя

тяжелая

 

Кол-во б-ных

n=4

n=2

n=2

n=11

n=4

n=1

n=20

СD14+CD282+,%

78,3±5,5

79,0±4,7

81,4±3,7*

87,0±4,5*

55,2±3,7

59,0**

66,7±0,8

СD14+CD284+,%

8,0±2,3*

10,1±1,4*

12,3±2,5*

14,7±1,9*

4,8±1,9**

7,0**

3,7±0,3

СD14+CD286+,%

5,5±1,5

5,7±1,1

7,8±1,3*

8,9±2,1*

4,4±1,0**

3,0**

3,4±0,2

Примечание: *- p<0,05 в сравнении с группой контроля, ** - p<0,05 в сравнении с группами в период рецидива заболевания.

Как следует из данных, представленных в таблице 2, изменение экспрессии СD14+CD282+ по сравнению с показателями группы контроля было наименьшим. Так, статистически значимое увеличение на 14,7 % и 20,3 % было зарегистрировано лишь в группе больных с поражением толстой и тонкой кишок, при среднетяжелом и тяжелом течении заболевания. Уровень TLR4 СD14+CD284+ изменялся в большей степени. Так, при поражении толстой кишки средней степени активности и тяжелом течении зарегистрировано увеличение количества моноцитов СD14+CD284+ в 2,2 раза и в 2,7 раза соответственно. При сочетанном поражении толстой и тонкой кишок в аналогичных по степени тяжести группах, количество моноцитов, экспрессирующих TLR4, увеличилось в 3,2 и 4,3 раза. Увеличение уровня TLR6СD14+CD286+ в 2,3 и 2,6 раза констатировано при средне-тяжелом и тяжелом течении БК при сочетанной локализации воспалительного процесса (p<0,05).

При достижении медикаментозно индуцированной ремиссии заболевания регистрировалось статистически достоверное снижение экспрессии СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ до значений уровней в группе контроля, что может свидетельствовать о тенденции к нормализации врожденного иммунного ответа (р>0,05).

На следующем этапе настоящего исследования нами был проведен внутригрупповой анализ между показателями экспрессии TLR у больных с рецидивом БК, в зависимости от распространённости воспалительного процесса в кишечной стенке.

Как следует из данных, представленных в таблице 3, зарегистрировано наличие сопряженности между увеличением экспрессии TLR и распространенностью воспалительного процесса. Так, при изолированном поражении толстой кишки экспрессия TLR 2 СD14+CD282+ в 1,1 и 1,2 раза превышала значение группы контроля.

Таблица 3

Экспрессия СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ у больных БК в зависимости от распространенности воспалительного процесса

Группа БК

1 группа

2 группа

Контрольная группа

 

n=6 (31,6 %)

n=13 (68,4 %)

n=20

СD14+CD282+, %

74,5±3,1*

82,2±3,1*

66,7±0,8

СD14+CD284+, %

9,4±1,6*

14,4±1,6*

3,7±0,3

СD14+CD286+, %

5,6±0,9*

8,4±1,4*

3,4±0,2

Примечание: * - p<0,05в сравнении с группой контроля.

Увеличение экспрессии TLR6 СD14+CD286+ на поверхности моноцитов было более значимой: констатировано увеличение в 1,6 раз и в 2,5 раза в 1 и 2 группах по сравнению с показателями группы контроля. Максимальное увеличение TLR6 СD14+CD284+в 2,5 и 3,5 раза зарегистрированов 1 и 2 группах наблюдения (p<0,005).

Таблица 4

Экспрессия СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ в зависимости от длительности заболевания

Количество больных

Впервые

n=3

1-10 лет

n=8

Более 10 лет

n=8

СD14+CD282+

75,3±4,7

81,1±5,1

83,1±2,1*

СD14+CD284+

7,5±1,9*

11,8±1,8*

15,8±2,1*

СD14+CD286+

3,1±1,5

6,9±1,3*

8,9±1,1*

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой контроля.

Учитывая выявленную закономерность, нами был проведен внутригрупповой анализ между показателями экспрессии TLR 2, 4, 6 и длительности БК. Результаты, представленные в таблице 4, наглядно демонстрируют однонаправленные изменения экспрессии TLR2 СD14+CD282+, TLR 4 СD14+CD284+ и TLR 6 4СD14+CD286+ у больных с БК в зависимости от длительности заболевания. Уровень моноцитов СD14+CD282+ и СD14+CD286+ у больных с впервые выявленным заболеванием и при длительности болезни до 1 года составил 75,3±4,7 % и 3,1±1,5 % и практически не отличался от значений группы контроля (р>0,05). Тенденция к увеличению количества моноцитовв 1,2 и в 2 раза зарегистрирована в диапазоне длительности болезни от 1-10 лет и более 10 лет (р<0,05). Максимальное увеличение TLR 2 и 6 зафиксировано при длительности БК более 10 лет: 83,1±2,1 % и 8,9±1,1 % соответственно, что превышало значения в группе контроля в 1,2 и 2,6 раза соответственно (р<0,05). При оценке прироста моноцитов, отражающих экспрессию TLR4, зарегистрирована аналогичная динамика изменений. Так, у больных с впервые выявленным заболеванием увеличение CD14+CD284+ превышало значения группы контроля в 2 раза, а при длительности заболевания более 10 лет, количество моноцитов составило 15,8±2,1 %, что в 4,3 раза превышало контрольные значения (р<0,05).

Учитывая выявленную зависимость между количеством моноцитов, экспрессирующих TLR2 СD14+CD282+, TLR4 СD14+CD284+ и TLR6 4СD14+CD286+, длительностью и активностью БК, был проведен корреляционный анализ. Результаты демонстрируют наличие прямой корреляции между экспрессией СD14+CD282+, СD14+CD284+, СD14+CD286+ и частотой дефекации (r=039,r=0,47, r=0,45 соответственно, при р<0,05), наличием патологических примесей в кале (r=0,64, r=0,55, r=0,60, при p<0,05), интенсивностью абдоминального болевого синдрома (r=0,72, r=0,57, r=0,60 соответственно, при p<0,05).

В настоящее время не утратила своего значения инфекционная теория возникновения ВЗК. В клинических исследованиях установлено, что у большинства больных с БК в период обострения заболевания регистрировались нарушениями микробиоты в виде изменения количественного и качественного состава микрофлоры кишечника. Результаты немногочисленных клинических исследований свидетельствуют о наличии при ВЗК детерминированной реакции иммунной системы на собственную микрофлору кишечника [8, 10].

Данные, представленные в таблице 5, демонстрируют наличие дисбиотических нарушений у всех больных в период рецидива заболевания. При достижении клинической ремиссии нарушения микробиоты толстой кишки зарегистрированы лишь 4 (21 %) случаях и характеризовались уменьшением количества бифидобактерий до 107-106 (КОЕ/г) илактобактерий до 105-104 (КОЕ/г). При проведении внутригруппового анализа между уровнем моноцитов CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+ и степенью дисбиотических изменений толстой кишки зарегистрировано наличие прямой зависимости (p<0,005). Так, количество CD14+CD284+иCD14+CD286+ при III степени дисбиотических расстройств составило 13,1±0,7 % и 10,2±0,7 %, что превышало уровень моноцитов у больных с I степенью в 1,7 и 1,5 раза. Зарегистрированные изменения позволяю высказать предположение о наличии реакции TLR4 и 6 с собственной измененной микробиотой толстой кишки.

Таблица 5

Показатели экспрессии CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+ у больных БК, имеющих нарушения в составе микрофлоры кишечника

Количество больных

I степень

n=4

II степень

n=7

III степень

n=8

Группа контроля

n=20

CD14+CD282+,%

76,3±3,0

81,5±2,8

85,6±3,9

66,7±0,8

CD14+CD284+,%

7,8±0,8

11,6±1,1

13,1±0,7*

3,7±0,3

CD14+CD286+,%

6,7±0,4

9,3±0,4

10,2±0,7*

3,4±0,2

Выводы:

  1. У больных с рецидивом БК выявлено увеличение количества моноцитов в периферической крови, ответственных за экспрессию CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+.
  2. Увеличение экспрессии CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+ находится в прямой зависимости от фазы воспалительного процесса и длительности БК. При достижении медикаментозно индуцированной клинической ремиссии заболевания регистрируется статистически достоверное снижение количества моноцитов, экспрессирующих CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+.
  3. Зарегистрировано наличие прямой зависимости между увеличением экспрессии CD14+CD284+ и CD14+CD286+ и степенью дисбиотических нарушений толстой кишки в периодрецидива БК.
  4. Выявлена достоверная прямая корреляционная связь между уровнем моноцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+ и клиническими маркерами рецидива БК.
  5. Снижение экспрессии CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD14+CD286+ на фоне базисной терапии БК может являться интегральным показателем отражающим достижение клинической ремиссии заболевания.

Рецензенты:

Погорелова Т. Н., д-р биол. наук, профессор, зав. отделом медико-биологических проблем ФГБУ «РНИИАП» Минздравсоцразвития России, г. Ростов-на-Дону.

Яковлев А. А., д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой гастроэнтерологии и эндоскопии с курсом клинической фармакологии ФПК и ППС РостГМУ, г. Ростов-на-Дону.


Библиографическая ссылка

Мамедова Л.Н. ОЦЕНКА ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В РАЗНЫЕ ФАЗЫ ТЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ КРОНА // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 3. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=9215 (дата обращения: 21.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074