Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

MODERN MICROSCOPY TECHNIQUES IN THE RESEARCH OF BIOLOGICAL OBJECTS

Potaturkina-nesterova N.I. 1 Nemova I.S. 2 Artamonova M.N. 2 Gorelnikova E.A. 3 Kuyarov A.A. 4 Potekhina L.P. 5 Radaeva O.A. 6 Samyshkina N.E. 7
1 Togliatti State University
2 Ulyanovsk State University
3 Saratov State Agrarian University named after N.I. Vavilov
4 Surgut State University - Khanty-Mansi Autonomous Okrug Ugra
5 Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis of the Urals Branch of the Russian Academy of Sciences
6 Ogarev Mordovia State University
7 Chelyabinsk State University
В статье рассмотрен вопрос применения атомно-силовой микроскопии и лазерной микроскопии в микробиологической диагностике. Высокое разрешение указанных методов позволяет использовать их для изучения архитектоники и особенностей строения, состава биопленок и межклеточных структур микроорганизмов. Атомно-силовая микроскопия позволяет изучить клеточные структуры, мембраны, вирусы, бактерии, ткани. Атомно-силовая микроскопия, лазерная микроскопия могут быть использованы для изучения физиологических процессов, таких как клеточный рост и прорастание спор, а также для исследования морфологических изменений живых бактерий под действием антибиотиков. Анализ литературных источников показал, что важным направлением является использование методов АСМ при оценке токсических действий, на моделях микроорганизмов, наноматериалов, применяемых в медицине. В качестве примеров представлены данные изучения живых объектов методами атомно-силовой микроскопии и лазерной микроскопии.
This article deals with a value of atomic force and laser microscopy in microbiological diagnostics. High resolution of these methods allows to use its for studying of architectonic and structure features, biofilms´ composition and intercellular structures of microorganisms. Atomic force microscopy allows to research cellular structures, membranes, viruses, bacteria, tissues. Atomic force microscopy, laser scanning microscopy can be used for studying of the physiological processes such as cell growth and spore germination, as well as for research of morphological changes in living bacteria under the influence of antibiotics. The analysis of references showed that the important direction is using of AFM methods at an assessment of toxic actions, on models of microorganisms, the nanomaterials applied in medicine. As examples results of the study of living objects by means of atomic force microscopy and laser microscopy are presented.
microorganisms’ identification
microbiology
laser scanning microscopy
atomic force microscopy

Важной задачей современной микробиологии является исследование морфологии биологических объектов, так как именно размеры и форма во многом определяют принцип их функционирования. Новые возможности для исследования параметров и морфологических признаков микроорганизмов дает атомно-силовая микроскопия (АСМ), позволяющая проводить исследование поверхности различных биологических объектов на воздухе и в жидких средах в сочетании с оптическим наблюдением процесса сканирования в реальном времени [3, 4, 5, 6, 8].

Широкое использование АСМ связано с важным преимуществом – нетребовательностью к электропроводности исследуемых образцов. Электронная сканирующая микроскопия позволяет получить 3D изображения поверхностных ультраструктур с молекулярным разрешением, в режиме реального времени и физиологических условиях, что значительно уменьшает количество времени, затраченное на исследование при традиционной световой микроскопии [7].

Методом АСМ можно изучить клеточные структуры, мембраны, вирусы, бактерии, ткани. Исследование подобных объектов представляет собой сложную задачу, прежде всего потому, что зонд находится в контакте с поверхностью и относительно большая сила              взаимодействия может привести к необратимой деформации объекта исследования и зонда. АСМ дает изображения бактериальных клеток и их поверхности с высоким разрешением. Эти изображения используются для анализа внешнего вида и свойств поверхности бактерий. АСМ может быть использована для изучения физиологических процессов, таких как клеточный рост и прорастание спор, а также для исследования морфологических изменений живых бактерий под действием антибиотиков [2].

Существует много методов работы АСМ. В зависимости от характера силы, действующей между зондом и образцом, различают контактный, бесконтактный и прерывисто-контактный («полуконтактный») методы силовой микроскопии  [11].

Режим прерывистого контакта позволяет повысить качество получаемого изображения. При таком способе сканирования с помощью пьезоэлектрического манипулятора осуществляются вынужденные механические колебания кантилевера с частотой, близкой к резонансной (обычно это десятки и сотни килогерц), и с амплитудой порядка 100 нм. В нижней точке колебаний остриё «касается» образца. При передвижении сканирующей иглы отслеживается изменение резонансной амплитуды кантилевера (она зависит от внешней силы). Данный метод позволяет повысить разрешение микроскопа при наблюдении объектов с пониженной механической жёсткостью, поскольку здесь устранено влияние капиллярных сил. При таком методе также исключаются различные латеральные силы и силы трения, которые могут приводить к смещению структур на плоскости образца. Для улучшения качества изображения исследуемый объект погружали в жидкость [1,5].

При АСМ бактерии иммобилизируют на подложку, что приводит к появлению третьего параметра. Используя АСМ, возможно не только определять размеры бактерий, но и сравнивать их поверхностные рисунки. Сканирование в жидкости позволяет изучать влияние на бактериальные клетки антибиотиков и других медицинских препаратов. При измерении упругих свойств бактериальной стенки можно получать информацию о внутреннем строении клетки. С помощью атомно-силовой микроскопии зарегистрировано изменение структуры липополисахаридов клеточной стенки бактерий Escherichia coli, наследующих генетическую детерминанту, которая контролирует синтез первичных боковых цепей дизентерийных бактерий. Такие бактерии могут быть использованы в качестве штаммов-носителей при изготовлении живых векторных вакцин [4, 13].

В собственных исследованиях измерение топологии поверхности образцов проводили при помощи атомно-силового микроскопа SoSolver PP447 компании NTNT--MMDT в режиме прерывистого контакта с использованием поставляемых в комплекте принадлежностей и применением пакета прикладных программ Nova (1.0.26.1324). В качестве зонда использовали кремниевый кантилевер марки NSG 10. Объектом исследования являлись взвеси культур Proteus spp., выделенные из фекалий обследованных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта на фоне бластоцистной инвазии.

а)б)

Рис. 1. Proteus spp. а – сканирующая электронная микроскопия; б – пространственное АСМ-изображение протей при площади сканирования (12×12 мкм2)

Определение шероховатости при помощи метода атомно-силовой микроскопии широко используется для оценки состояния различных объектов, однако существует лишь небольшое число работ, где он использовался для анализа поверхности клеток. В то же время использование интегрального параметра удобно при оценке действия на клетку различных физиологически и экзогенных факторов [4].

Для визуализации поверхности микробных клеток методами атомно-силовой микроскопии не требуются специальные подготовительные операции, обязательные для различных видов электронной микроскопии [12].

Процедура подготовки образцов для атомно-силовой микроскопии заключается в их иммобилизации на ровной подложке. Материал подложки можно варьировать в широких пределах в зависимости от поставленных задач. Традиционно в качестве субстрата используются атомно-гладкие подложки из слюды, графита и других слоистых материалов, а также различные стекла, полимерные материалы и металлические поверхности. Варьируя подложки, можно изучать адгезивные свойства бактерий на поверхности различных материалов [9,10] (рис. 2).

Рис. 2. Простейшие Blastocystis hominis: сканирующая электронная микроскопия

Для изучения биологических объектов в настоящее время активно используется лазерная микроскопия. Лазерная рентгеновская микроскопия – разновидность рентгеноструктурного анализа, основанного на дифракции рентгеновских лучей на исследуемом объекте. В отличие от традиционного рентгеноструктурного анализа, исследуется одиночные молекулы и их сочетания. Данный вид микроскопии позволяет получать изображения с разрешением в несколько нанометров [11]. В собственных исследованиях измерение топологии поверхности биологических объектов – клещей Demodex  folliculorum, проводили при помощи микроскопа LEXT OLS 4000.

Рис. 3. Сканы получены лазерной микроскопией (микроскоп LEXT OLS 4000): 50х50 мкм скан микроскопического клеща  Demodex  folliculorum

Таким образом, методы атомно-силовой микроскопии, лазерной микроскопии имеют широкие перспективы в изучении морфологических свойств микробиологических объектов. Возможность изучения топографии, морфологии, ультраструктуры бактериальных клеток и вирусов позволит расширить знания о микроорганизмах. Высокое разрешение указанных выше методов позволяет использовать их для изучения архитектоники и особенностей строения, состава биопленок и межклеточных структур микроорганизмов.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (№14.B37.21.2010)

Рецензенты:

Ильина Н. А., д.б.н., профессор кафедры зоологии, проректор по научной работе ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова»,  г. Ульяновск.

Нестеров А. С., д.м.н., профессор кафедры инфекционных и кожно-венерических болезней ФГБОУ ВПО «Ульяновский  государственный университет», г. Ульяновск.