Важной задачей современной микробиологии является исследование морфологии биологических объектов, так как именно размеры и форма во многом определяют принцип их функционирования. Новые возможности для исследования параметров и морфологических признаков микроорганизмов дает атомно-силовая микроскопия (АСМ), позволяющая проводить исследование поверхности различных биологических объектов на воздухе и в жидких средах в сочетании с оптическим наблюдением процесса сканирования в реальном времени [3, 4, 5, 6, 8].
Широкое использование АСМ связано с важным преимуществом – нетребовательностью к электропроводности исследуемых образцов. Электронная сканирующая микроскопия позволяет получить 3D изображения поверхностных ультраструктур с молекулярным разрешением, в режиме реального времени и физиологических условиях, что значительно уменьшает количество времени, затраченное на исследование при традиционной световой микроскопии [7].
Методом АСМ можно изучить клеточные структуры, мембраны, вирусы, бактерии, ткани. Исследование подобных объектов представляет собой сложную задачу, прежде всего потому, что зонд находится в контакте с поверхностью и относительно большая сила взаимодействия может привести к необратимой деформации объекта исследования и зонда. АСМ дает изображения бактериальных клеток и их поверхности с высоким разрешением. Эти изображения используются для анализа внешнего вида и свойств поверхности бактерий. АСМ может быть использована для изучения физиологических процессов, таких как клеточный рост и прорастание спор, а также для исследования морфологических изменений живых бактерий под действием антибиотиков [2].
Существует много методов работы АСМ. В зависимости от характера силы, действующей между зондом и образцом, различают контактный, бесконтактный и прерывисто-контактный («полуконтактный») методы силовой микроскопии [11].
Режим прерывистого контакта позволяет повысить качество получаемого изображения. При таком способе сканирования с помощью пьезоэлектрического манипулятора осуществляются вынужденные механические колебания кантилевера с частотой, близкой к резонансной (обычно это десятки и сотни килогерц), и с амплитудой порядка 100 нм. В нижней точке колебаний остриё «касается» образца. При передвижении сканирующей иглы отслеживается изменение резонансной амплитуды кантилевера (она зависит от внешней силы). Данный метод позволяет повысить разрешение микроскопа при наблюдении объектов с пониженной механической жёсткостью, поскольку здесь устранено влияние капиллярных сил. При таком методе также исключаются различные латеральные силы и силы трения, которые могут приводить к смещению структур на плоскости образца. Для улучшения качества изображения исследуемый объект погружали в жидкость [1,5].
При АСМ бактерии иммобилизируют на подложку, что приводит к появлению третьего параметра. Используя АСМ, возможно не только определять размеры бактерий, но и сравнивать их поверхностные рисунки. Сканирование в жидкости позволяет изучать влияние на бактериальные клетки антибиотиков и других медицинских препаратов. При измерении упругих свойств бактериальной стенки можно получать информацию о внутреннем строении клетки. С помощью атомно-силовой микроскопии зарегистрировано изменение структуры липополисахаридов клеточной стенки бактерий Escherichia coli, наследующих генетическую детерминанту, которая контролирует синтез первичных боковых цепей дизентерийных бактерий. Такие бактерии могут быть использованы в качестве штаммов-носителей при изготовлении живых векторных вакцин [4, 13].
В собственных исследованиях измерение топологии поверхности образцов проводили при помощи атомно-силового микроскопа SoSolver PP447 компании NTNT--MMDT в режиме прерывистого контакта с использованием поставляемых в комплекте принадлежностей и применением пакета прикладных программ Nova (1.0.26.1324). В качестве зонда использовали кремниевый кантилевер марки NSG 10. Объектом исследования являлись взвеси культур Proteus spp., выделенные из фекалий обследованных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта на фоне бластоцистной инвазии.
а)
б)
Рис. 1. Proteus spp. а – сканирующая электронная микроскопия; б – пространственное АСМ-изображение протей при площади сканирования (12×12 мкм2)
Определение шероховатости при помощи метода атомно-силовой микроскопии широко используется для оценки состояния различных объектов, однако существует лишь небольшое число работ, где он использовался для анализа поверхности клеток. В то же время использование интегрального параметра удобно при оценке действия на клетку различных физиологически и экзогенных факторов [4].
Для визуализации поверхности микробных клеток методами атомно-силовой микроскопии не требуются специальные подготовительные операции, обязательные для различных видов электронной микроскопии [12].
Процедура подготовки образцов для атомно-силовой микроскопии заключается в их иммобилизации на ровной подложке. Материал подложки можно варьировать в широких пределах в зависимости от поставленных задач. Традиционно в качестве субстрата используются атомно-гладкие подложки из слюды, графита и других слоистых материалов, а также различные стекла, полимерные материалы и металлические поверхности. Варьируя подложки, можно изучать адгезивные свойства бактерий на поверхности различных материалов [9,10] (рис. 2).
Рис. 2. Простейшие Blastocystis hominis: сканирующая электронная микроскопия
Для изучения биологических объектов в настоящее время активно используется лазерная микроскопия. Лазерная рентгеновская микроскопия – разновидность рентгеноструктурного анализа, основанного на дифракции рентгеновских лучей на исследуемом объекте. В отличие от традиционного рентгеноструктурного анализа, исследуется одиночные молекулы и их сочетания. Данный вид микроскопии позволяет получать изображения с разрешением в несколько нанометров [11]. В собственных исследованиях измерение топологии поверхности биологических объектов – клещей Demodex folliculorum, проводили при помощи микроскопа LEXT OLS 4000.
Рис. 3. Сканы получены лазерной микроскопией (микроскоп LEXT OLS 4000): 50х50 мкм скан микроскопического клеща Demodex folliculorum
Таким образом, методы атомно-силовой микроскопии, лазерной микроскопии имеют широкие перспективы в изучении морфологических свойств микробиологических объектов. Возможность изучения топографии, морфологии, ультраструктуры бактериальных клеток и вирусов позволит расширить знания о микроорганизмах. Высокое разрешение указанных выше методов позволяет использовать их для изучения архитектоники и особенностей строения, состава биопленок и межклеточных структур микроорганизмов.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (№14.B37.21.2010)Рецензенты:
Ильина Н. А., д.б.н., профессор кафедры зоологии, проректор по научной работе ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова», г. Ульяновск.
Нестеров А. С., д.м.н., профессор кафедры инфекционных и кожно-венерических болезней ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск.