Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ В ИЗУЧЕНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Потатуркина-Нестерова Н.И. 1 Немова И.С. 2 Артамонова М.Н. 2 Горельникова Е.А. 3 Куяров А.А. 4 Потехина Л.П. 5 Радаева О.А. 6 Самышкина Н.Е. 7
1 ФГБОУ ВПО «Тольяттинский государственный университет»
2 ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»
3 ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
4 ГБОУ ВПО «Сургутский государственный университет Ханты-Мансийского автономного округа Югры»
5 ФГБУН «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН»
6 ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева»
7 ФГБОУ ВПО «Челябинский Государственный Университет»
В статье рассмотрен вопрос применения атомно-силовой микроскопии и лазерной микроскопии в микробиологической диагностике. Высокое разрешение указанных методов позволяет использовать их для изучения архитектоники и особенностей строения, состава биопленок и межклеточных структур микроорганизмов. Атомно-силовая микроскопия позволяет изучить клеточные структуры, мембраны, вирусы, бактерии, ткани. Атомно-силовая микроскопия, лазерная микроскопия могут быть использованы для изучения физиологических процессов, таких как клеточный рост и прорастание спор, а также для исследования морфологических изменений живых бактерий под действием антибиотиков. Анализ литературных источников показал, что важным направлением является использование методов АСМ при оценке токсических действий, на моделях микроорганизмов, наноматериалов, применяемых в медицине. В качестве примеров представлены данные изучения живых объектов методами атомно-силовой микроскопии и лазерной микроскопии.
идентификация микроорганизмов
микробиология
лазерная микроскопия
атомно-силовая микроскопия
1. Бахтизин Р. З. Сканирующая туннельная микроскопия – новый метод изучения поверхности твердых тел // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – №11. – С. 83–89.
2. Большакова А. В., Воробьева Е. А. Сканирующая силовая микроскопия почвенных бактерий // Современные достижения бионаноскопии: тезисы докл. III Междун. конф. (16–18 июня 2009 г.). – Москва, 2009. – С.13.
3. Быков И. В. Развитие и автоматизация методов измерения рельефа и локальных свойств биологических объектов в атомно-силовой микроскопии: автореф. дис… канд. ф.-мат. наук. М., 2010. – 21 с.
4. Дерябин Д. Г., Васильченко А. С., Алешина Е. С. и др. Исследование взаимодействия углеродных наноматериалов с клетками Escherichia coli методом атомно-силовой микроскопии // Российские нанотехнологии. – 2010. – Т. 5, № 11–12. – С. 136–141.
5. Игнатов С. Г., Вирясов С. Н., Федюкина Г. Н. и др. Применение АСМ для специфической визуализации микроорганизмов // Молекулярная диагностика – 2007: тезисы докл. VI Всерос. научно-практ. конф. с междунар. участием. – М., 2007. – Т. 1. – С. 81-82.
6. Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии: учебное пособие для студентов старших курсов высших учебных заведений. – Нижний Новгород: РАН. Институт физики микроструктур, 2004. – 114 с.
7. Плескова С. Н. Атомно-силовая микроскопия в биологических и медицинских исследованиях. – ИД: Интеллект, 2011. – 288 с.
8. Поляков В. В., Рубашкина М. В., Смирнов В. А. Исследование параметров биологических объектов методом атомно-силовой микроскопии // Известия ЮФУ. Технические науки. – 2011. – № 4. – С.193–198.
9. Роскошная А. С., Багров Д. В., Онищенко Г. Е. и др. Применение атомно-силовой микроскопии для визуализации внутренней структуры клеток // Современные достижения бионаноскопии: тезисы докл. III Междун. конф. (16–18 июня 2009 г.). – М., 2009. – С.47.
10. Уткин Т. В., Бугоркова О. С., Кузнецов Н. А. и др. Современные возможности изучения ультраструктуры клеток // Известия Саратовского университета. Сер. Физика. – 2012. – Т.12. – С.36.
11. Феофанов А. В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях // Успехи биологической химии. – 2007. – Т.47. – С.371-410.
12. Филатов Д. О., Круглов А. В., Гущина Ю. Ю. Исследование топографии поверхностных твердых тел методом атомно-силовой микроскопии в неконтактном режиме. Описание лабораторной работы. – Н.Новгород: Нижегородский государственный университет, 2003. – С.5.
13. Яминский И. В., Демин В. В., Бондаренко В. М. Различия в клеточной поверхности гибридных бактерий Escherichia coli K12, наследующих rfb-а3,4 ген Shigella flexneri, выявляемые с помощью атомно-силовой микроскопии // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 1997. – № 6. – С. 15–18.

Важной задачей современной микробиологии является исследование морфологии биологических объектов, так как именно размеры и форма во многом определяют принцип их функционирования. Новые возможности для исследования параметров и морфологических признаков микроорганизмов дает атомно-силовая микроскопия (АСМ), позволяющая проводить исследование поверхности различных биологических объектов на воздухе и в жидких средах в сочетании с оптическим наблюдением процесса сканирования в реальном времени [3, 4, 5, 6, 8].

Широкое использование АСМ связано с важным преимуществом – нетребовательностью к электропроводности исследуемых образцов. Электронная сканирующая микроскопия позволяет получить 3D изображения поверхностных ультраструктур с молекулярным разрешением, в режиме реального времени и физиологических условиях, что значительно уменьшает количество времени, затраченное на исследование при традиционной световой микроскопии [7].

Методом АСМ можно изучить клеточные структуры, мембраны, вирусы, бактерии, ткани. Исследование подобных объектов представляет собой сложную задачу, прежде всего потому, что зонд находится в контакте с поверхностью и относительно большая сила              взаимодействия может привести к необратимой деформации объекта исследования и зонда. АСМ дает изображения бактериальных клеток и их поверхности с высоким разрешением. Эти изображения используются для анализа внешнего вида и свойств поверхности бактерий. АСМ может быть использована для изучения физиологических процессов, таких как клеточный рост и прорастание спор, а также для исследования морфологических изменений живых бактерий под действием антибиотиков [2].

Существует много методов работы АСМ. В зависимости от характера силы, действующей между зондом и образцом, различают контактный, бесконтактный и прерывисто-контактный («полуконтактный») методы силовой микроскопии  [11].

Режим прерывистого контакта позволяет повысить качество получаемого изображения. При таком способе сканирования с помощью пьезоэлектрического манипулятора осуществляются вынужденные механические колебания кантилевера с частотой, близкой к резонансной (обычно это десятки и сотни килогерц), и с амплитудой порядка 100 нм. В нижней точке колебаний остриё «касается» образца. При передвижении сканирующей иглы отслеживается изменение резонансной амплитуды кантилевера (она зависит от внешней силы). Данный метод позволяет повысить разрешение микроскопа при наблюдении объектов с пониженной механической жёсткостью, поскольку здесь устранено влияние капиллярных сил. При таком методе также исключаются различные латеральные силы и силы трения, которые могут приводить к смещению структур на плоскости образца. Для улучшения качества изображения исследуемый объект погружали в жидкость [1,5].

При АСМ бактерии иммобилизируют на подложку, что приводит к появлению третьего параметра. Используя АСМ, возможно не только определять размеры бактерий, но и сравнивать их поверхностные рисунки. Сканирование в жидкости позволяет изучать влияние на бактериальные клетки антибиотиков и других медицинских препаратов. При измерении упругих свойств бактериальной стенки можно получать информацию о внутреннем строении клетки. С помощью атомно-силовой микроскопии зарегистрировано изменение структуры липополисахаридов клеточной стенки бактерий Escherichia coli, наследующих генетическую детерминанту, которая контролирует синтез первичных боковых цепей дизентерийных бактерий. Такие бактерии могут быть использованы в качестве штаммов-носителей при изготовлении живых векторных вакцин [4, 13].

В собственных исследованиях измерение топологии поверхности образцов проводили при помощи атомно-силового микроскопа SoSolver PP447 компании NTNT--MMDT в режиме прерывистого контакта с использованием поставляемых в комплекте принадлежностей и применением пакета прикладных программ Nova (1.0.26.1324). В качестве зонда использовали кремниевый кантилевер марки NSG 10. Объектом исследования являлись взвеси культур Proteus spp., выделенные из фекалий обследованных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта на фоне бластоцистной инвазии.

а)б)

Рис. 1. Proteus spp. а – сканирующая электронная микроскопия; б – пространственное АСМ-изображение протей при площади сканирования (12×12 мкм2)

Определение шероховатости при помощи метода атомно-силовой микроскопии широко используется для оценки состояния различных объектов, однако существует лишь небольшое число работ, где он использовался для анализа поверхности клеток. В то же время использование интегрального параметра удобно при оценке действия на клетку различных физиологически и экзогенных факторов [4].

Для визуализации поверхности микробных клеток методами атомно-силовой микроскопии не требуются специальные подготовительные операции, обязательные для различных видов электронной микроскопии [12].

Процедура подготовки образцов для атомно-силовой микроскопии заключается в их иммобилизации на ровной подложке. Материал подложки можно варьировать в широких пределах в зависимости от поставленных задач. Традиционно в качестве субстрата используются атомно-гладкие подложки из слюды, графита и других слоистых материалов, а также различные стекла, полимерные материалы и металлические поверхности. Варьируя подложки, можно изучать адгезивные свойства бактерий на поверхности различных материалов [9,10] (рис. 2).

Рис. 2. Простейшие Blastocystis hominis: сканирующая электронная микроскопия

Для изучения биологических объектов в настоящее время активно используется лазерная микроскопия. Лазерная рентгеновская микроскопия – разновидность рентгеноструктурного анализа, основанного на дифракции рентгеновских лучей на исследуемом объекте. В отличие от традиционного рентгеноструктурного анализа, исследуется одиночные молекулы и их сочетания. Данный вид микроскопии позволяет получать изображения с разрешением в несколько нанометров [11]. В собственных исследованиях измерение топологии поверхности биологических объектов – клещей Demodex  folliculorum, проводили при помощи микроскопа LEXT OLS 4000.

Рис. 3. Сканы получены лазерной микроскопией (микроскоп LEXT OLS 4000): 50х50 мкм скан микроскопического клеща  Demodex  folliculorum

Таким образом, методы атомно-силовой микроскопии, лазерной микроскопии имеют широкие перспективы в изучении морфологических свойств микробиологических объектов. Возможность изучения топографии, морфологии, ультраструктуры бактериальных клеток и вирусов позволит расширить знания о микроорганизмах. Высокое разрешение указанных выше методов позволяет использовать их для изучения архитектоники и особенностей строения, состава биопленок и межклеточных структур микроорганизмов.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (№14.B37.21.2010)

Рецензенты:

Ильина Н. А., д.б.н., профессор кафедры зоологии, проректор по научной работе ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова»,  г. Ульяновск.

Нестеров А. С., д.м.н., профессор кафедры инфекционных и кожно-венерических болезней ФГБОУ ВПО «Ульяновский  государственный университет», г. Ульяновск.


Библиографическая ссылка

Потатуркина-Нестерова Н.И., Немова И.С., Артамонова М.Н., Горельникова Е.А., Куяров А.А., Потехина Л.П., Радаева О.А., Самышкина Н.Е. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ В ИЗУЧЕНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 6.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=7868 (дата обращения: 19.05.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252