Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

KINETIC APPROACHES TO A PROBLEM OF ANTIOXIDANT TEST. PART 2. WATER-LIPID MODEL

Журавлева Л.А., Крайник В.В., Ушкалова В.Н.
This article summarizes results of water-lipid kinetic model devising of antioxidant test. Micelle formation of two- and three-component systems (methyl linoleate : water, ethyl oleate : water, ethyl oleate : water: surface active substans) was tested. Optimal composition of water-lipid substratum was proposed on the basis of obtained results. Efficiency of standard approaches and original mathematical method of kinetic parameters calculation at testing antioxidants was researched. The efficiency of proposed model was estimated an example of such inhibitors as standard ionol and a natural α-tocopherole and synthetic capotene. The method of external standard (ionol as the external standard) has been offered for qualitive antioxidants testing. Some mathematical parameters such as winit, wmax, τ1, τ2, a for quantitative estimation of antioxidants were proposed.

В последние 30 лет получила признание гипотеза свободнорадикального механизма развития многих патологий путем нарушения проницаемости биомембран за счет изменения интенсивности свободнорадикального окисления липидов и полярности биомембран [4, 8]. Поэтому в медицине развивается метод антиоксидантотерапии для профилактики и лечения различных патологий [6, 7]. Очевидно, что прогресс в антиоксидантотерапии возможен на основе разработки способов тестирования эффективности водорастворимых антиоксидантов.

Как показано в предыдущем сообщении, большинство известных способов тестирования антиоксидантов рассчитано на безводную среду, применение в качестве субстратов этилбензола, кумола или их растворов в хлорбензоле [5, 9]. Приведены результаты тестирования природных и синтетических липидрастворимых антиоксидантов с помощью кинетической метиллинолеатной модели.

Для тестирования водорастворимых биоантиоксидантов известно применение биологических субстратов: микросом, суспензий митохондрий или желточных протеинов, модельных системы липосом, сформированных из раствора яичного лецитина в глициновом буфере [11, 12]. Однако, эти способы имеют качественный характер и не позволяют получать количественные, воспроизводимые результаты из-за нестандартности субстратов, а также невозможности оценивать механизм действия антиоксидантов из-за неизвестного механизма окисления субстратов.

В настоящей работе приведены результаты разработки и оценки эффективности кинетической водно-липидной модели тестирования антиоксидантов. С этой целью разработан оптимальный состав водно-липидного субстрата, исследована эффективность стандартных подходов при тестировании антиоксидантов в безводных растворах, а также оригинального кинетического подхода. Модель апробирована на примере стандартного, синтетического и природного ингибиторов – ионола, α-токоферола и капотена.

Методы эксперимента

Условия окисления и волюмометрических измерений, получение метиллинолеата, очистка ионола (2, 6-дитретбутил-4-метилфенола), капотена (1-[(2S)-3-метилпропионил]-L-пролина), α-токоферо-ла (2, 5, 7, 8-тетраметил-2-(4, 8, 12-триметилтридецил)-6-оксихроман) описаны в предыдущем сообщении (сообщ. 1). Этилолеат получали из олеиновой кислоты марки «ч.» путем реакции этерификации пятикратным избытком абсолютного спирта в кислой среде с последующей экстракцией эфиром и вакуумной перегонкой [3]. Цетилтриметиламмоний бромид марки «х.ч.» используют без дополнительной очистки. Хлорид меди очищают кристаллизацией, используют бидистиллированную воду.

Результаты исследования

Для разработки способа тестирования водорастворимых антиоксидантов исследовано мицеллообразование в двух- и трехкомпонентных системах: вода – этилолеат или метиллинолеат, вода – ПАВ, вода – ПАВ – эфир. В качестве ПАВ исследуют цетилтриметиламмоний бромид, додецилсульфонат натрия. По наименьшей величине критической концентрации мицеллообразования (1–3)∙10-3 моль/л в качестве эмульгатора выбран цетилтриметиламмоний бромид. Большинство последующих экспериментов проведено с этилолеатом, как более доступным субстратом. Поскольку большинство промышленных инициаторов не совместимы с водой, то для ускорения процесса окисления использованы катализаторы. Для оценки их эффективности исследована кинетика окисления этил-олеата в присутствии солей CuCl2, FeCl2, FeCl3, CoCl2, NiCl2 в зависимости от концентрации. Результаты приведены на рис.1.

Из рисунка видна экстремальная зависимость скорости окисления от концентрации исследованных катализаторов. Для большинства катализаторов, кроме катионов кобальта максимум соответствует концентрациям (1 – 2)∙10-3 моль/л. Для катионов кобальта максимальная скорость окисления достигается при концентрации (6–8)∙10-3 моль/л. Наиболее эффективным является хлорид меди, который выбран в качестве рабочего катализатора.

Каталитическая активность исследованных солей падает в ряду: Cu2+>Fe2+>Fe3+>Co2+>Ni2+. В целом, по результатам проведенных исследований подобран состав субстрата, который содержит эмульсию этилолеатат в воде в соотношении 1 : 3 (по объему), добавки цетилтриметиламмония бромида и хлорида меди в концентрациях (1–3)∙10-3 моль/л.

Для оценки возможности тестирования антиоксидантов исследована кинетика окисления указанного субстрата в присутствии стандартного синтетического ингибитора – ионола в зависимости от его концентрации. Типичные кинетические кривые (КК) приведены на рис. 2.

Из рисунка видно, что ионол тормозит процесс окисления водно-липидного субстрата пропорционально концентрации.

По описанной в предыдущем сообщении методике вычислены значения  при разных концентрациях ионола. Результаты приведены в табл. 1.

Из таблицы видно изменение значений  примерно в 10 раз при изменении концентрации ионола  в 10 раз, что свидетельствует о сложном механизме его действия в водно-липидном субстрате. Поскольку параметр  не может служить критерием эффективности ингибитора в водно-липидном субстрате, то результаты эксперимента обработаны путем аппроксимации КК методом наименьших квадратов и последующего их дифференцирования. Результаты приведены в табл. 2.

В качестве критериев эффективности и механизма действия ингибитора в водно-липидном субстрате использованы описанные ранее кинетические параметры: начальная (Wнач), максимальная (Wmаx) скорости окисления, периоды полного торможения (τ1) и окончания ускорения (τ2), ускорение (а). По начальной скорости и периоду полного торможения судят об эффективности обрыва цепей на ингибиторе. По уменьшению максимальной скорости окисления с увеличением концентрации ингибитора судят об участии продуктов превращения ингибитора в реакциях обрыва цепей. По уменьшению величины ускорения с увеличением концентрации ингибитора судят об участии продуктов его превращения в реакциях разветвления цепей. Период окончания ускорения характеризует выход процесса на максимальную скорость и полный расход ингибитора. Кинетические параметры, приведенные в табл. 2 свидетельствуют о сложном механизме действия ионола в водно-липидном субстрате и о возможном его участии в реакциях продолжения и разветвления цепей. Тогда возможная схема механизма каталитического окисления водно-липидного субстрата в присутствии ионола включает дополнительные реакции:

Инициирование цепей:

                                       (0.1)

Разветвление цепей:

                                     (3.3)

Обрыв цепей:

                                                    (7)

                                            (8)

                                                      (9)

Таким образом, предлагаемый метод позволяет не только оценить эффективность ингибитора, но и сделать предположение о механизме его действия.

α-токоферол относят к важнейшим биоантиоксидантам, регулирующим интенсивность свободнорадикального окисления липидов биомембран и отвечающего за их проницаемость и формирование патологий [1, 10, 13]. В предыдущем сообщении (сообщ. 1) приведены высокие значения  для α-токоферола в стироле и этилбензоле [2], а также показано, что в растворе метиллинолеата он действует по сложному механизму, как слабый ингибитор. В литературе мы не встречали данных об оценке эффективности α-токоферола в водных средах, поэтому представляло большой интерес исследовать его эффект в водно-липидном субстрате. С этой целью исследовано влияние α-токоферола на окисление водно-липидного субстрата в широком интервале концентраций от 1∙10-8 до 1∙10-1 моль/л. Типичные результаты приведены на рис. 3.

Из рисунка видно, что α-токоферол при концентрациях 1∙10-8 – 6∙10-4 моль/л слабо тормозит процесс, а при концентрациях 1∙10-3 – 1∙10-1 моль/л ускоряет процесс. Результаты свидетельствуют об изменении механизма действия в водно-липидной модели не только у ионола, но и у α-токоферола по сравнению с окислением безводных субстратов. В водно-липидном субстрате α-токоферол действует как буфер, ускоряя процесс при одних концентрациях и замедляя процесс при других концентрациях. Именно такой механизм действия характерен для многих биологически активных соединений (холестерина, гормонов), обеспечивающих гомеостаз.

В предыдущем сообщении (сообщ. 1) капотен использован в качестве представителей тиолов. В настоящем сообщении приведены результаты исследования его антиоксидантной активности в водно-липидной среде. Типичные КК окисления водно-липидного субстрата приведены на рис. 4.

Из рисунка видно, что эффективное торможение наблюдается только при высоких концентрациях, превышающих 1∙10-3 моль/л, когда количество тиола равно или превышает концентрацию катализатора.

Для количественной оценки результатов и исследования механизма действия капотена КК аппроксимировали функциями, как описано выше, с последующим их дифференцированием. Рассчитаны кинетические параметры. Этот подход позволил выявить особенности влияния капотена в зависимости от концентрации. В результате показано (табл. 3), что при концентрациях капотена 1∙10-6 – 1∙10-4 моль/л наблюдаются два участка КК подобно контрольной пробе.

При концентрациях капотена 1∙10-3 моль/л и выше КК аппроксимируют тремя функциями, что свидетельствует об изменении механизма действия. Количественные показатели: WначWmаx,τ1τ2а совпадают с контрольной пробой вплоть до 1∙10-4 моль/л концентрации капотена. Уменьшение начальной скорости и ускорения, увеличение τ1 и τ2 наблюдается, начиная с концентрации капотена 1∙10-3 моль/л. Максимальная скорость и ускорение остаются постоянными при всех концентрациях капотена. Представленные результаты позволяют сделать вывод о том, что капотен в присутствии катионов меди легко окисляется подобно метиллинолеату. Процесс протекает по схеме:

Инициирование:

                                  (0.2)

                                       (0.3)

Продолжение цепей:

                                                  (1)

                                           (2)

Обрыв цепей:

                                               (4)

                                             (5)

Вероятно, радикалы тиола менее активны, чем радикалы метиллинолеата, поэтому они рекомбинируют и не участвуют в реакциях продолжения цепей. Они быстро выводятся из процесса, практически не влияя на кинетику.

При концентрациях капотена в 5 – 50 раз, превышающих концентрацию катализатора, его избыток начинает участвовать в реакции обрыва цепей, обеспечивая торможение процесса. Схема механизма дополняется реакцией:

                                      (6)

Одинаковые максимальные скорости окисления, ускорения в контрольной пробе и в пробах с навеской капотена свидетельствуют о том, что продукты окисления капотена не участвуют в процессе окисления.

Выводы

Предложен состав водно-липидной системы для тестирования антиоксидантов.

Для качественной оценки эффективности тестируемых антиоксидантов предложен метод внешнего стандарта.

Для количественной оценки эффективности и механизма действия антиоксидантов предложен математический метод обработки кинетических кривых.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1.  Аристархова С.А. Изучение ингибирующей активности токоферолов / С.А. Аристархова, Е.Б. Бурлакова, Н.Г. Храпова // Известия АН СССР. Сер. хим., 1972. – № 12. – С. 2714 – 2718.

2.  Бурлакова Е.Б. Кинетические особенности токоферолов как антиоксидантов: Препринт / Е.Б. Бурлакова, С.А. Крашаков, Н.Г. Храпова – Черноголовка, 1992. – 56с.

3.  Васильева Н.В. Органический синтез: Учебн. пособие / Н.В. Васильева, Т.А. Смолина, В.К. Тимофеева и др. – М.: Просвящение, 1986. – 367с.

4.  Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков – М.: Наука, 1972. – 231с.

5.  Денисов Е.Т. Механизмы гомолитического распада молекул в жидкой фазе // Итоги науки и техники. Сер. «Кинетика и катализ». – 1981. – Т. 9. – С. 1.

6.  Джанашия П.Х., Назаренко В.А., Николенко С.А. Современные аспекты клинического применения ингибиторов ангиотензинпрерывающего фермента. – М.: РГМУ, 1999. – 48с.

7.  Кобалова Ж.Д., Котовская Ю.В. Артериальная гипертония: ключевые аспекты дифференциальной диагностики, профилактики, клиники и лечения. М.: Фортэ - АРТ, 2001 – 208с.

8.  Крепс Е.М. Липиды клеточных мембран. – М.: Наука, 1981. – 339с.

9.  Семенов Н.Н. Цепные реакции. – М.: Наука, 1986. – 535с.

10.  Ушкалова В.Н. Содержание, антиоксидантная активность и стабильность токоферолов в пищевых липидах // Вопросы питания, 1986. – № 3. – С. 10 – 17.

11.  Харитонова А.А. Кинетический анализ свойств антиоксидантов в сложных композициях с помощью модельной цепной реакции / А.А. Харитонова, З.К. Козлова, Б.Ф. Цепалов, Г.П. Гладышев // Кинетика и катализ. – 1979. – Т. 20. – № 3. – С. 593 – 599.

12.  Шелушенко Н.И. Определение ингибирующей эффективности антиоксидантов на модели аскорбатзависимого перекисного окисления липидов биологических мембран / Н.И. Шелушенко, С.А. Аристархова, Л.Н. Шишкина // Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro in vivo. – М.: Наука, 1992. – С. 76 – 79.

13.  Yanishlieva N. Natural antioxidants in lipid oxidation / N. Yanishlieva, E. Marinova // Buld. Chem. Commun. – 2003. – V. 35. – № 2. – P. 79 – 91.