Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

КИНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ПРОБЛЕМЕ ТЕСТИРОВАНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ. С. 2. ВОДНО-ЛИПИДНАЯ МОДЕЛЬ

Журавлева Л.А., Крайник В.В., Ушкалова В.Н.
В настоящей работе приведены результаты разработки и оценки эффективности водно-липидной кинетической модели тестирования антиоксидантов. Путем исследования мицеллообразования в двух- и трехкомпонентных системах (метиллинолеат : вода; этилолеат : вода; этилолеат : вода : ПАВ) разработан оптимальный состав водно-липидного субстрата, исследована эффективность стандартных подходов и оригинального математического метода расчета кинетических параметров тестирования антиоксидантов. Модель апробирована на примере стандартного, синтетического и природного ингибиторов – ионола, α-токоферола и капотена. Для качественной оценки эффективности тестируемых антиоксидантов предложен метод внешнего стандарта (ионол как внешний стандарт). Для количественной оценки – математические критерии: wн, wmax, τ1, τ2, a.

В последние 30 лет получила признание гипотеза свободнорадикального механизма развития многих патологий путем нарушения проницаемости биомембран за счет изменения интенсивности свободнорадикального окисления липидов и полярности биомембран [4, 8]. Поэтому в медицине развивается метод антиоксидантотерапии для профилактики и лечения различных патологий [6, 7]. Очевидно, что прогресс в антиоксидантотерапии возможен на основе разработки способов тестирования эффективности водорастворимых антиоксидантов.

Как показано в предыдущем сообщении, большинство известных способов тестирования антиоксидантов рассчитано на безводную среду, применение в качестве субстратов этилбензола, кумола или их растворов в хлорбензоле [5, 9]. Приведены результаты тестирования природных и синтетических липидрастворимых антиоксидантов с помощью кинетической метиллинолеатной модели.

Для тестирования водорастворимых биоантиоксидантов известно применение биологических субстратов: микросом, суспензий митохондрий или желточных протеинов, модельных системы липосом, сформированных из раствора яичного лецитина в глициновом буфере [11, 12]. Однако, эти способы имеют качественный характер и не позволяют получать количественные, воспроизводимые результаты из-за нестандартности субстратов, а также невозможности оценивать механизм действия антиоксидантов из-за неизвестного механизма окисления субстратов.

В настоящей работе приведены результаты разработки и оценки эффективности кинетической водно-липидной модели тестирования антиоксидантов. С этой целью разработан оптимальный состав водно-липидного субстрата, исследована эффективность стандартных подходов при тестировании антиоксидантов в безводных растворах, а также оригинального кинетического подхода. Модель апробирована на примере стандартного, синтетического и природного ингибиторов – ионола, α-токоферола и капотена.

Методы эксперимента

Условия окисления и волюмометрических измерений, получение метиллинолеата, очистка ионола (2, 6-дитретбутил-4-метилфенола), капотена (1-[(2S)-3-метилпропионил]-L-пролина), α-токоферо-ла (2, 5, 7, 8-тетраметил-2-(4, 8, 12-триметилтридецил)-6-оксихроман) описаны в предыдущем сообщении (сообщ. 1). Этилолеат получали из олеиновой кислоты марки «ч.» путем реакции этерификации пятикратным избытком абсолютного спирта в кислой среде с последующей экстракцией эфиром и вакуумной перегонкой [3]. Цетилтриметиламмоний бромид марки «х.ч.» используют без дополнительной очистки. Хлорид меди очищают кристаллизацией, используют бидистиллированную воду.

Результаты исследования

Для разработки способа тестирования водорастворимых антиоксидантов исследовано мицеллообразование в двух- и трехкомпонентных системах: вода – этилолеат или метиллинолеат, вода – ПАВ, вода – ПАВ – эфир. В качестве ПАВ исследуют цетилтриметиламмоний бромид, додецилсульфонат натрия. По наименьшей величине критической концентрации мицеллообразования (1–3)∙10-3 моль/л в качестве эмульгатора выбран цетилтриметиламмоний бромид. Большинство последующих экспериментов проведено с этилолеатом, как более доступным субстратом. Поскольку большинство промышленных инициаторов не совместимы с водой, то для ускорения процесса окисления использованы катализаторы. Для оценки их эффективности исследована кинетика окисления этил-олеата в присутствии солей CuCl2, FeCl2, FeCl3, CoCl2, NiCl2 в зависимости от концентрации. Результаты приведены на рис.1.

Из рисунка видна экстремальная зависимость скорости окисления от концентрации исследованных катализаторов. Для большинства катализаторов, кроме катионов кобальта максимум соответствует концентрациям (1 – 2)∙10-3 моль/л. Для катионов кобальта максимальная скорость окисления достигается при концентрации (6–8)∙10-3 моль/л. Наиболее эффективным является хлорид меди, который выбран в качестве рабочего катализатора.

Каталитическая активность исследованных солей падает в ряду: Cu2+>Fe2+>Fe3+>Co2+>Ni2+. В целом, по результатам проведенных исследований подобран состав субстрата, который содержит эмульсию этилолеатат в воде в соотношении 1 : 3 (по объему), добавки цетилтриметиламмония бромида и хлорида меди в концентрациях (1–3)∙10-3 моль/л.

Для оценки возможности тестирования антиоксидантов исследована кинетика окисления указанного субстрата в присутствии стандартного синтетического ингибитора – ионола в зависимости от его концентрации. Типичные кинетические кривые (КК) приведены на рис. 2.

Из рисунка видно, что ионол тормозит процесс окисления водно-липидного субстрата пропорционально концентрации.

По описанной в предыдущем сообщении методике вычислены значения  при разных концентрациях ионола. Результаты приведены в табл. 1.

Из таблицы видно изменение значений  примерно в 10 раз при изменении концентрации ионола  в 10 раз, что свидетельствует о сложном механизме его действия в водно-липидном субстрате. Поскольку параметр  не может служить критерием эффективности ингибитора в водно-липидном субстрате, то результаты эксперимента обработаны путем аппроксимации КК методом наименьших квадратов и последующего их дифференцирования. Результаты приведены в табл. 2.

В качестве критериев эффективности и механизма действия ингибитора в водно-липидном субстрате использованы описанные ранее кинетические параметры: начальная (Wнач), максимальная (Wmаx) скорости окисления, периоды полного торможения (τ1) и окончания ускорения (τ2), ускорение (а). По начальной скорости и периоду полного торможения судят об эффективности обрыва цепей на ингибиторе. По уменьшению максимальной скорости окисления с увеличением концентрации ингибитора судят об участии продуктов превращения ингибитора в реакциях обрыва цепей. По уменьшению величины ускорения с увеличением концентрации ингибитора судят об участии продуктов его превращения в реакциях разветвления цепей. Период окончания ускорения характеризует выход процесса на максимальную скорость и полный расход ингибитора. Кинетические параметры, приведенные в табл. 2 свидетельствуют о сложном механизме действия ионола в водно-липидном субстрате и о возможном его участии в реакциях продолжения и разветвления цепей. Тогда возможная схема механизма каталитического окисления водно-липидного субстрата в присутствии ионола включает дополнительные реакции:

Инициирование цепей:

                                       (0.1)

Разветвление цепей:

                                     (3.3)

Обрыв цепей:

                                                    (7)

                                            (8)

                                                      (9)

Таким образом, предлагаемый метод позволяет не только оценить эффективность ингибитора, но и сделать предположение о механизме его действия.

α-токоферол относят к важнейшим биоантиоксидантам, регулирующим интенсивность свободнорадикального окисления липидов биомембран и отвечающего за их проницаемость и формирование патологий [1, 10, 13]. В предыдущем сообщении (сообщ. 1) приведены высокие значения  для α-токоферола в стироле и этилбензоле [2], а также показано, что в растворе метиллинолеата он действует по сложному механизму, как слабый ингибитор. В литературе мы не встречали данных об оценке эффективности α-токоферола в водных средах, поэтому представляло большой интерес исследовать его эффект в водно-липидном субстрате. С этой целью исследовано влияние α-токоферола на окисление водно-липидного субстрата в широком интервале концентраций от 1∙10-8 до 1∙10-1 моль/л. Типичные результаты приведены на рис. 3.

Из рисунка видно, что α-токоферол при концентрациях 1∙10-8 – 6∙10-4 моль/л слабо тормозит процесс, а при концентрациях 1∙10-3 – 1∙10-1 моль/л ускоряет процесс. Результаты свидетельствуют об изменении механизма действия в водно-липидной модели не только у ионола, но и у α-токоферола по сравнению с окислением безводных субстратов. В водно-липидном субстрате α-токоферол действует как буфер, ускоряя процесс при одних концентрациях и замедляя процесс при других концентрациях. Именно такой механизм действия характерен для многих биологически активных соединений (холестерина, гормонов), обеспечивающих гомеостаз.

В предыдущем сообщении (сообщ. 1) капотен использован в качестве представителей тиолов. В настоящем сообщении приведены результаты исследования его антиоксидантной активности в водно-липидной среде. Типичные КК окисления водно-липидного субстрата приведены на рис. 4.

Из рисунка видно, что эффективное торможение наблюдается только при высоких концентрациях, превышающих 1∙10-3 моль/л, когда количество тиола равно или превышает концентрацию катализатора.

Для количественной оценки результатов и исследования механизма действия капотена КК аппроксимировали функциями, как описано выше, с последующим их дифференцированием. Рассчитаны кинетические параметры. Этот подход позволил выявить особенности влияния капотена в зависимости от концентрации. В результате показано (табл. 3), что при концентрациях капотена 1∙10-6 – 1∙10-4 моль/л наблюдаются два участка КК подобно контрольной пробе.

При концентрациях капотена 1∙10-3 моль/л и выше КК аппроксимируют тремя функциями, что свидетельствует об изменении механизма действия. Количественные показатели: WначWmаx,τ1τ2а совпадают с контрольной пробой вплоть до 1∙10-4 моль/л концентрации капотена. Уменьшение начальной скорости и ускорения, увеличение τ1 и τ2 наблюдается, начиная с концентрации капотена 1∙10-3 моль/л. Максимальная скорость и ускорение остаются постоянными при всех концентрациях капотена. Представленные результаты позволяют сделать вывод о том, что капотен в присутствии катионов меди легко окисляется подобно метиллинолеату. Процесс протекает по схеме:

Инициирование:

                                  (0.2)

                                       (0.3)

Продолжение цепей:

                                                  (1)

                                           (2)

Обрыв цепей:

                                               (4)

                                             (5)

Вероятно, радикалы тиола менее активны, чем радикалы метиллинолеата, поэтому они рекомбинируют и не участвуют в реакциях продолжения цепей. Они быстро выводятся из процесса, практически не влияя на кинетику.

При концентрациях капотена в 5 – 50 раз, превышающих концентрацию катализатора, его избыток начинает участвовать в реакции обрыва цепей, обеспечивая торможение процесса. Схема механизма дополняется реакцией:

                                      (6)

Одинаковые максимальные скорости окисления, ускорения в контрольной пробе и в пробах с навеской капотена свидетельствуют о том, что продукты окисления капотена не участвуют в процессе окисления.

Выводы

Предложен состав водно-липидной системы для тестирования антиоксидантов.

Для качественной оценки эффективности тестируемых антиоксидантов предложен метод внешнего стандарта.

Для количественной оценки эффективности и механизма действия антиоксидантов предложен математический метод обработки кинетических кривых.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1.  Аристархова С.А. Изучение ингибирующей активности токоферолов / С.А. Аристархова, Е.Б. Бурлакова, Н.Г. Храпова // Известия АН СССР. Сер. хим., 1972. – № 12. – С. 2714 – 2718.

2.  Бурлакова Е.Б. Кинетические особенности токоферолов как антиоксидантов: Препринт / Е.Б. Бурлакова, С.А. Крашаков, Н.Г. Храпова – Черноголовка, 1992. – 56с.

3.  Васильева Н.В. Органический синтез: Учебн. пособие / Н.В. Васильева, Т.А. Смолина, В.К. Тимофеева и др. – М.: Просвящение, 1986. – 367с.

4.  Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков – М.: Наука, 1972. – 231с.

5.  Денисов Е.Т. Механизмы гомолитического распада молекул в жидкой фазе // Итоги науки и техники. Сер. «Кинетика и катализ». – 1981. – Т. 9. – С. 1.

6.  Джанашия П.Х., Назаренко В.А., Николенко С.А. Современные аспекты клинического применения ингибиторов ангиотензинпрерывающего фермента. – М.: РГМУ, 1999. – 48с.

7.  Кобалова Ж.Д., Котовская Ю.В. Артериальная гипертония: ключевые аспекты дифференциальной диагностики, профилактики, клиники и лечения. М.: Фортэ - АРТ, 2001 – 208с.

8.  Крепс Е.М. Липиды клеточных мембран. – М.: Наука, 1981. – 339с.

9.  Семенов Н.Н. Цепные реакции. – М.: Наука, 1986. – 535с.

10.  Ушкалова В.Н. Содержание, антиоксидантная активность и стабильность токоферолов в пищевых липидах // Вопросы питания, 1986. – № 3. – С. 10 – 17.

11.  Харитонова А.А. Кинетический анализ свойств антиоксидантов в сложных композициях с помощью модельной цепной реакции / А.А. Харитонова, З.К. Козлова, Б.Ф. Цепалов, Г.П. Гладышев // Кинетика и катализ. – 1979. – Т. 20. – № 3. – С. 593 – 599.

12.  Шелушенко Н.И. Определение ингибирующей эффективности антиоксидантов на модели аскорбатзависимого перекисного окисления липидов биологических мембран / Н.И. Шелушенко, С.А. Аристархова, Л.Н. Шишкина // Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro in vivo. – М.: Наука, 1992. – С. 76 – 79.

13.  Yanishlieva N. Natural antioxidants in lipid oxidation / N. Yanishlieva, E. Marinova // Buld. Chem. Commun. – 2003. – V. 35. – № 2. – P. 79 – 91.


Библиографическая ссылка

Журавлева Л.А., Крайник В.В., Ушкалова В.Н. КИНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ПРОБЛЕМЕ ТЕСТИРОВАНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ. С. 2. ВОДНО-ЛИПИДНАЯ МОДЕЛЬ // Современные проблемы науки и образования. – 2008. – № 3. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=786 (дата обращения: 02.12.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074