Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

KINETIC APPROACHES TO A PROBLEM OF ANTIOXIDANT TEST. PART 1. METHYL LENOLEATE MODEL

Журавлева Л.А., Ушкалова В.Н.
This article summarizes results of methyl linoleate (LMe) kinetic model devising wich antioxidants tests. The data were found by research LMe oxidation kinetic in chlorbenzene solution depending on initiator 2, 2΄-azobisisobutyronitril concentration. The efficiency of proposed model was estimated an example of such inhibitors as standard ionol (2, 6-ditretbutyl-4-methylphenol), and a natural bioantioxidant tocopherole and pharmaceuticals capotene (l-[(2S)-3-merkapto-2-methyl-propio-nyl]-L-proline). The method of calculation of antioxidants efficiency estimation was offered. It was based on kinetic functions derivative. Comparison of kinetic parameters of inhibitors was carried out. It was shown, that LMe kinetic model allows to estimate efficiency and the mechanism of antioxidants action; to classify antioxidants into three types: strong, buffer and weak by method of the external standard; to recommend conditions in which the antioxidant was most effective.

Разработка экспрессных, эффективных способов тестирования антиоксидантов является одной из актуальных проблем современной химии, так как антиоксиданты определяют многие технологии: хранение и переработка жиров, масел, масляных фармпрепаратов, полимеров, топлив.

В настоящее время широкое развитие получает антиоксидантотерапия для профилактики и лечения многих заболеваний, процессов старения, адаптации к стрессам, неблагоприятным воздействиям окружающей среды. В связи с этим, существует большой интерес к поиску новых, эффективных средств антиоксидантотерапии и совершенствованию известных, разработке новых способов тестирования антиоксидантов. Известные способы тестирования антиоксидантов основаны на теории цепных разветвленных процессов жидкофазного окисления углеводородов и их производных [7, 8, 12].

Настоящая работа посвящена исследованию кинетики окисления растворов метиллинолеата в хлорбензоле в зависимости от концентраций инициатора и ингибиторов: ионола, α-токоферола, капотена и разработке на этой основе способов оценки эффективности ингибиторов.

С этой целью предложены критерии оценки эффективности и механизма действия антиоксидантов на основе аппроксимации и дифференцирования функций, соответствующих кинетическим кривым (КК) окисления.

В следующем сообщении будут приведены результаты соответствующих исследований в водно-липидных системах.

Методы эксперимента

Окисление осуществляют в термостатированной ячейке при 60о ±0,2оС при непрерывном перемешивании со скоростью 1200 об./мин. Концентрацию поглощенного кислорода определяют волюмометрически. В качестве инициатора использован 2, 2´-азобисизобутиронитрил (АИБН) марки «ч», который очищают путем многократной последовательной кристаллизации из этанола, ацетона, бензола с последующей осушкой в вакуумном эксикаторе и хранением при –10оС [4]. Метиллинолеат (МЛ) получают путем метилирования линолевой кислоты четырехкратным избытком метанола при комнатной температуре с последующей вакуумной перегонкой и очисткой путем кристаллизации с мочевиной в растворе метанола [3]. Ионол (2, 6-дитретбутил-4-метилфенол) марки «ч.» очищают двукратной кристаллизацией из абсолютного этанола при температуре 68,5оС. α-токоферол (2, 5, 7, 8-тетраметил-2-(4, 8, 12-триметилтридецил)-6-оксихроман) фирмы «Serva» и капотен в виде субстанции (1-[(2S)-3-метилпропио-нил]-L-пролина) используют без дополнительной очистки. Хлорбензол очищают экстракцией примесей концентрированной серной кислотой по известной методике [9] с последующей ректификационной перегонкой и отбором пробы с температурой 132оС.

Результаты исследования

Механизм инициированного окисления углеводородов описывается схемой:

Инициирование цепей:

         

                           (0)

Продолжение цепей:

                                         (1)

                                  (2)

Разветвление цепей:

                                        (3.1)

                                   (3.2)

Обрыв цепей:

                                               (4)

Для подтверждения соответствия механизма окисления МЛ приведенной схеме сравнивают теоретически рассчитанные и экспериментально определенные скорости окисления. Скорость определяется лимитирующей стадией процесса (2) и, в соответствии со схемой, описывается выражением (1):

,                                            (1)

где  – константа скорости продолжения цепей;

 – константа скорости обрыва цепей.

Из литературы [6, 11] известны значения  и  для МЛ при 60оС и соответственно равны 81,38 и 4,42∙106 л∙моль-1·с-1. Концентрация МЛ в растворе хлорбензола составляет 1,5 моль/л.

Скорость инициирования вычисляется по известному [13] для растворов углеводородов в хлорбензоле выражению (2):

                                                   (2)

где [I] – концентрация инициатора, моль·дм-3;

l = 1,2 – эффективность выхода радикалов из "клетки" в растворах хлорбензола;

Кi – константа скорости распада АИБН (л·моль–1·с–1), которую вычисляют по известному для метиллинолеата [14] выражению (3):

                                                  (3)

В результате для концентраций АИБН, равных 2∙10-3; 6∙10-3; 6∙10-2 моль/л получены значения скоростей: 1,4∙10-9; 2,98∙10-9; 2,98∙10-8 моль·л–1·с–1 соответственно.

Экспериментально изучают окисление растворов МЛ в хлорбензоле в соотношении 1 : 1 (по объему) для различных концентраций инициатора. Типичные КК для трех концентраций АИБН приведены на рисунке 1.

 

По наклону линейных участков КК графическим методом вычисляют скорость окисления. В результате получены значения скоростей (1,7±0,3)×10–9; (3,0±0,2)×10–9; (3,0±0,3)×10–8 моль×л-1×с-1 для указанных концентраций инициатора соответственно. Получены близкие значения расчетных и экспериментальных скоростей инициирования, что свидетельствует о соответствии механизма процесса окисления МЛ приведенному механизму.

Далее исследована кинетика инициированного окисления МЛ в зависимости от концентрации ионола. Ионол известен как стандартный сильный синтетический ингибитор углеводородов. К сильным ингибиторам, по современной классификации относятся ингибиторы, участвующие только в реакциях обрыва цепей [6, 7, 8]:

                                        (5)                                 

                                                                       (6)

К слабым – относят ингибиторы, участвующие не только в реакциях обрыва, но и в реакциях продолжения и разветвления цепей:

                                                  (7)

                           (8)

В соответствии с приведенной схемой механизма скорость окисления в присутствии сильного ингибитора определяется выражением:

,                                      (4)

где  – константа скорости обрыва цепей на ингибиторе, л∙моль–1·с–1;

 – стехиометрический коэффициент ингибирования, определяющий число обрывов цепей на одной молекуле ингибитора, для ионола ;

 – концентрация ингибитора, моль/л.

Эффективность ингибитора определяется величиной константы . Для ионола в этилбензоле и других углеводородах при 60оС она определена и составляет (2,6±0,4)×104 л×моль-1×с-1 [6, 11]. На рис. 2 приведены типичные КК окисления МЛ в присутствии 6×10-3 моль/л АИБН при различных концентрациях ионола.

По начальным участкам КК графическим методом вычисляют скорость окисления МЛ в присутствии ингибитора. С целью увеличения точности, вычисления производят в разных точках, а результаты усредняют. Возможно также вычисление скорости как величины обратной периоду полного торможения. По выражению (5), выведенному из выражения (4) при известных параметрах  и  вычисляют .всех исследованных концентраций ионола при различных скоростях инициирования:

                                              (5)

Результаты вычислений приведены в табл. 1.

Из таблицы видно, что константа скорости обрыва цепей на ионоле при изученных условиях окисления не зависит от концентрации ингибитора и практически не зависит от скорости инициирования.

Результаты показывают, что эффективность сильных ингибиторов для тор-можения процессов окисления липидов можно оценивать по результатам опреде-ления кинетических параметров инициированного окисления МЛ. В качестве критерия сильного ингибитора нужно использовать постоянство значений  при различных скоростях инициирования и концентрациях ингибитора. Тогда критерием эффективности ингибитора служит величина .

Далее метиллинолеатная модель использована для исследования кине-тики и механизма действия биоантиоксидантов. Важнейшим биоантиокси-дантом животных и растительных клеток признан α-токоферол. Из литерату-ры [1, 2, 5] известен сложный механизм действия α-токоферола в углеводо-родах, его участие в реакциях продолжения цепей. Константа скорости обрыва цепей определена Ингольдом в стироле при 60оС, как субстрате в котором не-возможно участие α-токоферола в реакциях продолжения цепей и составляет (2,6±0,4)·106 л∙моль-1·с-1. В этилбензоле константа скорости обрыва цепей на α-токофероле определена Е. Бурлаковой с соавторами [2] при 37оС она состав-ляет (3,3±0,4)·106 л∙моль-1·с-1.

Далее приведены результаты оценки антиоксидантной активности α-то-коферола по величине . С этой целью исследована кинетика окисления метиллинолеата в зависимости от концентрации α-токоферола при различных скоростях инициирования. Типичные КК приведены на рис. 3.

На начальных участках КК, как показано выше, определены скорости окисления МЛ в присутствии α-токоферола. По выражению (5) вычислены значения , которые сведены в табл. 2.Из таблицы видно, что при всех исследованных скоростях инициирования параметр  уменьшается с увеличением концентрации α-токоферола примерно в 10 – 100 раз, что вероятно связано с его участием в реакциях продолжения цепей.

Представленные результаты показывают, что параметр  для α-то-коферола отражает вклад различных элементарных реакций, поэтому он не может использоваться в качестве показателя эффективности обрыва цепей, что будет, видимо, характерно для всех других ингибиторов подобного типа.

Для оценки эффективности «слабых ингибиторов», для липидных суб-стратов предлагается метод внешнего стандарта. С этой целью необходимо сравнить в идентичных условиях кинетику окисления МЛ в присутствии оди-наковых концентраций ионола и тестируемого ингибитора. Типичные КК окисления метиллинолеата в присутствии ионола и α-токоферола приведены на рис. 4.

Рисунок показывает различный характер КК окисления МЛ присутствии ионола и α-токоферола при одинаковых концентрациях. В присутствии α-токо-ферола всегда наблюдается меньший период индукции, более плавный и продол-жительный период ускорения, что указывает на меньшую его антиоксидантную активность по сравнению с ионолом. Сравнение  для некоторых одинаковых концентраций ионола и α-токоферола приведено в табл. 3.

Из таблицы видно, что при всех скоростях инициирования  для ионола имеет постоянные значения, в то время как  для α-токоферола зависят от его концентрации и скорости инициирования. В целом, метод внешнего стандарта позволяет сделать вывод о сложном или простом механизме действия тестируемого ингибитора, а также прогнозировать его эффективность по сравнению с ионолом.

Таблица 3. Расчет константы скорости обрыва цепей на ионоле и α-токофероле в условиях метиллинолеатной модели

Для более детальной оценки и прогнозирования эффективности тестируемых ингибиторов нами разработан метод математической оценки кинетических параметров. С этой целью исходные КК аппроксимируют по участкам методом наименьших квадратов наилучшими функциями, которые далее дифференцируют. В результате получают пять кинетических параметров:  – начальная и максимальная скорости,  – период полного торможения и окончания ускорения,  – ускорение. Эти параметры позволяют оценить не только эффективность торможения, но и механизм действия ингибиторов. Эффективность торможения оценивают по величинам . Наличие перегибов на участке ускорения оценивают как разветвление цепей с участием и без участия ингибитора. Сравнение  контроля и  в пробе с ингибитором позволяют судить об участии ингибитора или продуктов его окисления в реакциях продолжения цепей. Типичные результаты приведены на рис. 5.

Далее методом внешнего стандарта и математической обработки оценивают эффективность и механизм действия лекарственного гипотензивного препарата капотена – тиола по своей химической природе в зависимости от скорости инициирования и концентрации. Типичные КК приведены на рис. 6.

Показан аутоускоренный характер КК. При соотношении инициатора и ингибитора (6000 – 120) : 1 наблюдается снижение начальной и максимальной скоростей на 15 и 35% соответственно. При соотношении компонентов 12 : 1 сохраняется характер влияния, но величина снижения скоростей уменьшается до 10 и 15% соответственно. При соотношении 6 : 1 начальная скорость возрастает  на 10%, а максимальная скорость снижается на 15%. При соотношении 1 : (1,3 – 17) начальная скорость увеличивается  на 40%, а максимальная скорость не меняется или возрастает. Далее эффективность капотена оценена математически (табл. 4).

Таблица 4. Кинетические параметры окисления раствора метиллинолеата в хлорбензоле в присутствии капотена при Wi = 3,0·10–9 моль·л–1·с–1

Показано, что повышение концентрации капотена снижает его эффективность вплоть до промотирования процесса, а максимальная скорость возрастает. Эти факты, вероятно, связаны с конкурирующим участием капотена в реакциях обрыва (6), продолжения (5) и зарождения цепей (реакции 0.1 и 0.2) за счет связи S–H:

                                     (0.1)

                                (0.2)

Таблица 5. Результаты вычисления величины fKt 5 на капотене при окислении раствора МЛ в хлорбензоле при Wi = 3,0·10–9 моль·л–1·с–1

Параметр fKt5 уменьшается обратно пропорционально концентрации (табл. 5), что подтверждает сложный механизм действия капотена.

Таким образом, метиллинолеатная кинетическая модель позволяет оценить капотен как слабый ингибитор в условиях инициированного окисления.

На примере двух нетоксичных соединений: природного и синтетического, показана применимость метода внешнего стандарта для качественной и количественной оценки эффективности биоантиоксидантов.

Метиллинолеатная кинетическая модель позволяет оценить эффективность и механизм действия ингибиторов и классифицировать их как сильные, буферного действия и слабые, рекомендовать условия, в которых ингибиторы могут быть наиболее эффективны.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1.  Аристархова С.А., Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. // Известия АН СССР. Серия химическая. - 1972. - № 12. - С. 2714-2718.

2.  Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г. Кинетические особенности токоферолов как антиоксидантов // Препринт. Черноголовка, 1992. – 56с.

3.  Будацкий Н.П., Савенков Н.М. Мягкий метод синтеза метиловых эфиров высших жирных кислот // Масло-жировая промышл., 1969. - № 10. – С. 14 – 15.

4.  Гук А.Ф., Цепалов В.Ф.//Кинетика и катализ. – 1971. – Т. 12. – В. 4. – № 6. – С. 910-913.

5.  Гольденберг В.И., Тенцова А.И., Дмитричук Н.А. и др. // Хим. фарм. журнал. 1976. – Т. 10. – № 6. – С. 99 – 104.

6.  Денисов Е.Т. Константы скорости гомолитических жидкофазных реакций. – М.: Наука, 1971. – 711с.

7.  Денисов Е.Т., Эмануэль Н.М. // Кинетика и катализ. – 1973. – Т. 14. – № 4. – С. 823 – 825.

8.  Денисов Е.Т. // Успехи химии. – 1973. – Т. 43. – № 3. – С. 361 – 389.

9.  Реутов О.А., Курц А.Л., Бутин К.П. Органическая химия: Уч. пос.: В 2 ч. – М.: Изд-во МГУ, 1999. – Ч. 1. – 560с.

10.  Ушкалова В.Н., Ионидис Н. В., Кадочникова Г.Д. и др. Контроль перекисного окисления липидов // Новосибирск: Наука, 1993. – 181с.

11.  Цепалов В.Ф., Харитонова А.А., Гладышева Г.П., Эмануэль Н.М. // Кинетика и катализ. – 1977. – Т. 18. – № 5. – С. 1261 – 1267.

12.  Эмануэль Н.М. // Известия АК СССР. Серия химическая. – 1974. - № 5. – С. 1056 – 1072.

13.  Янишлиева Н., Скибида И., Майзус З. // Известия АН Болгария. Серия химия. – 1971. – Т. 4. – С. 1 – 4.