В настоящее время по своей социальной значимости грипп занимает одно из лидирующих мест среди всех инфекционных болезней человека. Эволюция вируса гриппа продолжается, и постоянно возникают новые антигенные варианты, которые вызывают ежегодные эпидемии этого заболевания. Кроме этого, внезапно появляются штаммы, к которым нет иммунитета у большинства людей, результатом являются пандемии.
Для специфической профилактики и лечения гриппозной инфекции известны две группы препаратов, обладающих доказанной клинической эффективностью: блокаторы М2-каналов (амантадин и ремантадин), активные только в отношении вируса гриппа А, и ингибиторы вирусной нейраминидазы (занамивир и озельтамивир), используемые для лечения вируса гриппа А и В [5]. В России также используется созданный на основе отечественных разработок арбидол, обладающий интерферониндуцирующими и иммуномодулирующими свойствами и усиливающий фагоцитарную функцию макрофагов [2]. Полагают, что арбидол препятствует слиянию липидной оболочки вируса с клеточными мембранами, однако точный механизм противовирусного действия препарата пока не установлен. Следует также отметить, что рандомизированных исследований арбидола не проводилось, есть только опыт клинического применения, который свидетельствует о его эффективности и хорошей переносимости. В целом, опыт применения противовирусных препаратов указывает на необходимость использования комбинации нескольких лекарственных средств для повышения эффективности лечения вирусной инфекции и устранения возможности появления резистентных вариантов вирусов. Поэтому вопрос о необходимости разработки и поиска новых лекарственных средств защиты от гриппозной инфекции, включающих как профилактические, так и лечебные препараты, представляется крайне важным и особо актуальным.
В последние годы внимание исследователей во многих странах направлено на изучение возможности использования в качестве источника биологически активных и лечебных веществ высших грибов - базидиомицетов [1; 8]. Лекарственные свойства некоторых базидиомицетов, включая гастеромицеты, известны давно. Так, в народной медицине Индии и Китая, начиная с 17 века, водные и спиртовые настойки из высушенных или свежих плодовых тел гастеромицетов используют при гастритах, почечных заболеваниях, для лечения кожных ран, язв, корост, а также в качестве противовоспалительного средства. В Венгрии грибы гастеромицеты применяют при лечении подагры и ревматизма. Мазь из веселки обыкновенной применяют и в официальной медицине при ревматизме [3].
В настоящей работе проведено исследование токсических и противовирусных свойств водных экстрактов высших грибов группы порядков гастеромицеты в отношении вируса гриппа А (субтипов H1N1, H3N2, H5N1) и вируса гриппа В in vitro и in vivo.
Материалы и методы
Экспериментальные образцы грибных экстрактов. В работе использовали водные экстракты из следующих грибов гастеромицетов: Lycoperdon pеrlatum, Battarrea phalloides, Dictyophora duplicate, Gastrosporium simplex, Geastrum fimbriatum, Calvatia lilacina, Chlorophyllum agaricoides, Lycoperdon utriforme, Lycoperdon umbrinum. Для приготовления образцов грибных экстрактов сухие плодовые тела грибов смешивали с дистиллированной водой в соотношении 1:50, выдерживали на кипящей водяной бане в течение 6 часов, затем фильтровали через тканевый фильтр.
Культура клеток. Для определения токсичности и противовирусной активности грибных экстрактов использовали перевиваемую линию клеток почки собаки кокер-спаниеля MDCK, полученную из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Клеточную суспензию разводили предварительно подогретой до температуры 37 ºC средой RPMI-1640 (ООО «БиолоТ» г. Санкт-Петербург), содержащей 5 % сыворотки крови плодов коровы (ООО «БиолоТ» г. Санкт-Петербург), до концентрации 1,0-1,5×105 клеток/мл и вносили по 100 мкл/лунку 96-луночного планшета. Затем планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37 ºC, 5 % СО2 и 100 % влажности на 2-3 сут до образования клеточного монослоя.
Вирусы. В работе использовали штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и адаптированный к лабораторным мышам штамм вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), полученные из отдела «Коллекция микроорганизмов» ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и наработанные на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) в отделе профилактики и лечения ООИ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» [3]. Кроме того, в работе были использованы штаммы вируса гриппа человека: A/Novosibirsk/129k/2011 (H1N1), B/ Novosibirsk/91k/2011 и B/Novosibirsk/SJ/2011, полученные и выделенные на культуре клеток MDCK сотрудниками отдела зоонозных инфекций и гриппа ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» из мазков больных, жителей г. Новосибирска: от женщины 1987 г. р., начало заболевания 08.02.2011 г.; от девочки 1998 г. р., начало заболевания 29.01.2011 г.; от девочки 6 лет, начало заболевания 09.01.2011 г. соответственно [4; 7].
Определение токсичности экстрактов грибов in vitro. Для определения токсических доз образцы грибных экстрактов разводили в несколько раз (в 2 раза, 5 раз, в 10, 100, 1000, 10000 раз) средой RPMI-1640, содержащей 5 % сыворотки крови плодов коровы, вносили на монослой клеток MDCK по 100 мкл/лунку планшета и ставили в термостат при температуре 37 ºC, 5 % СО2 и 100 % влажности. Наличие или отсутствие токсического действия экстрактов грибов на монослой клеток MDCK оценивали с помощью инвертированного микроскопа через 2 сут [6].
Определение токсичности экстрактов грибов in vivo. Для определения токсических доз грибных экстрактов в опытах на беспородных белых мышах массой 14-16 г полученные образцы разводили дистиллированной водой (в 2 раза, 5, 10, 50, 100 раз). В субхроническом эксперименте на беспородных белых мышах обоего пола испытывали влияние экстрактов грибов на общее состояние животных. Образцы вводили перорально (по 200 мкл/мышь) 1 раз в сутки в течение 5 дней. За животными наблюдали в течение 30 дней. Затем проводили взвешивание мышей в опыте и контроле, а также взвешивание внутренних органов животных опытных и контрольных групп: тимуса, селезенки, печени [6].
Определение противовирусной активности экстрактов грибов in vitro. В исследованиях по определению противовирусной активности грибных экстрактов использовали их максимально переносимые концентрации (МПК). Готовили разведения вируссодержащей жидкости от 1 до 8 с десятикратным шагом на среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности грибных экстрактов в профилактической схеме на монослой культуры клеток MDCK вносили образцы в объеме 50 мкл/лунку в максимально нетоксичной концентрации, после инкубирования клеток при температуре 37 °С в атмосфере 5 % CO2 в течение 1 ч вносили разведения вируссодержащей жидкости в объеме 50 мкл/лунку и вновь инкубировали клетки в течение 2-3 суток при температуре 37 °С в атмосфере 5 % CO2. По окончании инкубирования клеток регистрировали цитопатическое действие вируса (ЦПД) в монослое клеток с помощью инвертированного микроскопа и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1 % эритроцитами петуха [6].
Определение протективных свойств экстрактов гастеромицетов в отношении вируса гриппа А в опытах in vivo. В опытах по изучению протективных свойств экстрактов в отношении вируса гриппа А использовали следующие схемы: экстренно профилактическую - экстракты вводили перорально мышам (по 200 мкл/мышь) через час после заражения вирусом гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2) в дозе (10 ЛД50~ 3,6 lg ТЦД50), далее экстракты вводили 1 раз в сутки в течение 5 суток; лечебно-профилактическую - экстракты вводили перорально мышам (по 200 мкл/мышь) за час до заражения вирусом гриппа А/ Aichi/2/68 (H3N2) (10 ЛД50~ 3,6 lg ТЦД50), далее экстракты вводили 1 раз в сутки в течение 5 суток. За животными наблюдали в течение 14 суток. Высчитывали процент выживаемости животных в опыте и контроле, коэффициент защиты (КЗ) и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей. КЗ высчитывали по формуле: % гибели мышей в контроле - % гибели мышей в опыте .
Результаты и обсуждение
Цитотоксическое действие экстрактов гастеромицетов на клетки MDCK. Установлено, что 50 %-я цитотоксическая доза (ТС50) экстрактов, полученных из плодовых тел грибов гастеромицетов, составляла от 0,2 до 1,3 мг/мл для разных образцов (табл. 1).
Изучение цитотоксического действия экстрактов грибов гастеромицетов в опытах на беспородных белых мышах. При наблюдении за мышами в течение и после курса введения экстрактов грибов в опытах при оценке хронической токсичности, отклонений во внешнем виде, состоянии шерстного покрова, характере выделений, поведении не выявлено. Введение экстрактов не влияло на прибавку массы тела животных в опыте по сравнению с контролем. Проведенный морфометрический анализ не обнаружил отличий в относительной массе внутренних органов у беспородных белых мышей в опытных и контрольной группах.
Изучение протективных свойств экстрактов грибов гастеромицетов в отношении вирусов гриппа А и В in vitro. Для оценки противовирусной активности грибных экстрактов в опытах использовали их нетоксические дозы. Данные противовирусной активности грибных экстрактов в отношении вирусов гриппа А и В приведены в табл. 1 и 2. Представленные результаты показывают, что экстракты грибов весьма эффективно подавляют размножение трех штаммов вируса гриппа А и двух штаммов вируса гриппа В в культуре клеток. Индексы нейтрализации (ИН) вируса гриппа птиц A/chiken/Kurgan/05/2005 (H5N1) для большинства образцов составляли 1,1 - 3,0 lg, ИН вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) составляли 1,0-2,5 lg, а ИН изолята A/Novosibirsk/129k/2011 (H1N1), выделенного от больного человека в Новосибирске, грибными экстрактами были наибольшими из всех использованных в работе вирусов гриппа А и составляли 1,8-4,8 lg (табл. 1). Изучение противовирусной активности экстрактов гастеромицетов в отношении вирусов гриппа В показало, что эта противовирусная активность существенно превосходит активность экстрактов в отношении вирусов гриппа А (ИН изолята B/Novosibirsk/SJ/2011составляли 2,7-3,3 lg для всех исследованных образцов, а ИН другого изолята B/Novosibirsk/91k/2011 для всех экстрактов были наибольшими в настоящей работе и составляли 4,5-5,5 lg) (табл. 2). Важно, что экстракты (Lycoperdon pеrlatum № 10-47, Battarrea phalloides № 10-49 и Lycoperdon umbrinum № 10-58), обнаружившие наибольшую противовирусную активность в отношении всех использованных в исследовании вирусов гриппа, обладали низкой токсичностью для эукариотических клеток.
Изучение протективных свойств экстрактов грибов гастеромицетов в отношении вируса гриппа А в опытах на беспородных белых мышах. В опытах in vivo, проведенных по лечебно-профилактической схеме, введение мышам экстрактов №№ 10-47, 10-48 и 10-58 до заражения вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) и после заражения в течение 5 суток вызывало значительную защиту животных (83,4, 66,8 и 49,8 % соответственно). В инфицированной группе сравнения (введение Тамифлю) и контрольной инфицированной группе (введение дистиллированной воды) выжило 100 и 50 % животных, соответственно. Наибольший коэффициент защиты, который составлял 33,4 %, проявил экстракт, выделенный из гриба Lycoperdon pеrlatum (табл. 3). При экстренно профилактической схеме использования экстрактов гастеромицетов на лабораторных мышах установлено, что процент выживаемости животных составлял от 35,0 до 61,0 % (100,0 и 24,1 % - при введении Тамифлю и дистиллированной воды соответственно), а коэффициент защиты варьировал в опыте от 10,9 до 36,9 % (КЗ для Тамифлю составил 75,9 %) (табл. 3). При экстренно профилактической схеме на лабораторных животных, как и при лечебно- профилактической, наибольшей противовирусной активностью обладал экстракт на основе гриба Lycoperdon pеrlatum (табл. 3).
Таблица 1 Противовирусная активность экстрактов гастеромицетов в клетках MDCK, зараженных вирусом гриппа А (профилактическая схема)
|
Образец |
Концентрация сухого вещества в экстракте, мг/мл |
Токсичность для культуры клеток MDCK (ТС50), мг/мл |
Инфекционность вируса (титр) в клетках MDCK в lg ТЦД50/мл (М±I95, n=3) |
Индекс нейтрализации (Титр контроль - Титр опыт), lg |
|||||
|
Наименование |
№№ |
A/Aichi/ 2/68 (H3N2) |
A/chiken/Kurgan /05/2005 (H5N1) |
A/Novosibirsk /129k/2011 (H1N1) |
A/Aichi/ 2/68 (H3N2) |
A/chiken/Kurgan /05/2005 (H5N1) |
A/Novosibirsk /129k/2011 (H1N1) |
||
|
Lycoperdon pеrlatum |
10-47
|
2,5 |
0,6 |
1,8 ± 0,7* |
4,8 ± 0,7# |
2,0 ± 0,4@ |
2,5 |
3,0 |
2,8 |
|
Lycoperdon pеrlatum |
10-48 |
1,5 |
0,4 |
2,8 ± 0,4* |
5,8 ± 1,2 |
3,0 ± 0,3@ |
1,5 |
2,0 |
1,8 |
|
Battarrea phalloides |
10-49 |
1,5 |
0,2 |
2,8 ± 0,5* |
6,5 ± 0,7 |
0@ |
1,5 |
1,3 |
4,8 |
|
Dictyophora duplicata |
10-50 |
2,5 |
0,6 |
1,8 ± 0,7* |
5,8 ± 1,2 |
3,0 ± 0,3@ |
2,5 |
2,0 |
1,8 |
|
Gastrosporium simplex |
10-51
|
0,5 |
0,3 |
3,8 ± 0,5 |
6,0 ± 0,2# |
0@ |
0,5 |
1,8 |
4,8 |
|
Geastrum fimbriatum |
10-52
|
0,5 |
0,3 |
3,8 ± 1,0 |
6,7 ± 1,1 |
3,0 ± 0,3@ |
0,5 |
1,1 |
1,8 |
|
Lycoperdon pratense |
10-53 |
1,0 |
0,5 |
3,3 ± 0,5 |
6,0 ± 0,2# |
3,0 ± 0,3@ |
1,0 |
1,8 |
1,8 |
|
Lycoperdon umbrinum |
10-54
|
1,0 |
0,5 |
3,3 ± 0,5 |
7,5 ± 0,9 |
3,0 ± 0,3@ |
1,0 |
0,3 |
1,8 |
|
Calvatia lilacina |
10-55 |
1,0 |
0,5 |
3,3 ± 1,0 |
5,8 ± 1,0 |
3,0 ± 0,3@ |
1,0 |
2,0 |
1,8 |
|
Chlorophyllum agaricoides |
10-56
|
2,5 |
1,3 |
1,8 ± 0,5* |
5,7 ± 0,9 |
3,0 ± 0,3@ |
2,5 |
2,1 |
1,8 |
|
Lycoperdon utriforme |
10-57
|
1,0 |
0,2 |
3,3 ± 1,2 |
7,6 ± 0,7 |
3,0 ± 0,3@ |
1,0 |
0,2 |
1,8 |
|
Lycoperdon umbrinum |
10-58 |
2,5 |
0,3 |
1,8 ± 0,4* |
6,0 ± 0,7 |
3,0 ± 0,3@ |
2,5 |
1,8 |
1,8 |
Примечание: М-среднее арифметическое, I95-ошибка среднего, * титр вируса А/ Aichi/2/68 в опытах отличается от титра в контроле (4,3±0,5 lg ТЦД50/мл) по t-критерию Стьюдента при р ≤ 0,05; #-титр вируса A/chiken/Kurgan/05/2005 в опытах отличается от титра в контроле (7,8±1,0 lg ТЦД50/мл) по t-критерию Стьюдента при р ≤ 0,05; @-титр вируса A/Novosibirsk/129k/2011 в опытах отличается от титра в контроле (4,8±0,49 lg ТЦД50/мл) по t-критерию Стьюдента при р ≤ 0,05; n-число экспериментов.
Таблица 2
Противовирусная активность экстрактов грибов гастеромицетов в культуре клеток MDCK, зараженных вирусом гриппа В (профилактическая схема)
|
Образец |
Инфекционность вируса (титр КВЖ) в клетках MDCK в lg ТЦД50/ мл (М±I95, n=3) |
Индекс нейтрализации (Титр контроль - Титр опыт), lg |
|||
|
Наименование |
№№ |
B/ Novosibirsk/ 91k/2011 |
B/Novosibirsk/ SJ/2011 |
B/Novosibirsk/ 91k/2011 |
B/Novosibirsk/SJ/2011 |
|
Lycoperdon pеrlatum |
10-47 |
0* |
0@ |
5,5 |
3,3 |
|
Lycoperdon pеrlatum |
10-48 |
0,53±0,07* |
0,24±0,10@ |
5,0 |
3,0 |
|
Battarrea phalloides |
10-49 |
0,53±0,07* |
0,24±0,10@ |
5,0 |
3,0 |
|
Dictyophora duplicata |
10-50 |
0,70±0,05* |
0,43±0,07@ |
4,8 |
2,8 |
|
Gastrosporium simplex |
10-51 |
0,33±0,08* |
0,24±0,10@ |
5,2 |
3,0 |
|
Geastrum fimbriatum |
10-52 |
0,33±0,08* |
0,24±0,10@ |
5,2 |
3,0 |
|
Lycoperdon pratense |
10-53 |
0,43±0,07* |
0,24±0,10@ |
5,1 |
3,0 |
|
Lycoperdon umbrinum |
10-54 |
0* |
0@ |
5,5 |
3,3 |
|
Calvatia lilacina |
10-55 |
0,43±0,07* |
0,24±0,10@ |
5,1 |
3,0 |
|
Chlorophyllum agaricoides |
10-56
|
0,33±0,08* |
0,24±0,10@ |
5,2 |
3,0 |
|
Lycoperdon utriforme |
10-57 |
1,03±0,38* |
0,53±0,07@ |
4,5 |
2,7 |
|
Lycoperdon umbrinum |
10-58 |
0* |
0@ |
5,5 |
3,3 |
Примечание: М - среднее арифметическое, I95 - ошибка среднего, n - число опытов; * - титр вируса B/ Novosibirsk/91k/2011 в опытах достоверно отличается от титра вируса в контроле (без экстрактов) (5,5 ± 0,4 lg ТЦД50/мл) по t-критерию Стьюдента при р ≤ 0,05; @ - титр вируса B/ Novosibirsk/SJ/2011 в опытах достоверно отличается от титра вируса в контроле (без экстрактов) (3,25 ± 0,38 lg ТЦД50/мл) по t-критерию Стьюдента при р ≤ 0,05.
Заключение
Таким образом, водные экстракты плодовых тел гастеромицетов малотоксичны для линии клеток MDCK и лабораторных мышей, а также способны ингибировать репликацию вирусов гриппа А и В как штаммов прошлых лет, так и недавно выделенных изолятов от больных, на культуре клеток MDCK, а также частично защищать лабораторных животных от заражения летальной дозой вируса гриппа. Это позволяет говорить о хорошей перспективе использования водных экстрактов высших грибов - гастеромицетов как основы для разработки противогриппозных препаратов.
Таблица 3
Протективные свойства экстрактов гастеромицетов в отношении вируса гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2) в экспериментах на лабораторных мышах
|
Образец |
Показатели защиты животных при (n=10) |
||||||
|
лечебно-профилактической схеме |
экстренно профилактической схеме |
||||||
|
Наименование |
№№ |
Выживаемость, % |
КЗ, % |
СПЖ, сутки (М± Sm) |
Выживаемость, % |
КЗ, % |
СПЖ, сутки (М± Sm) |
|
Lycoperdon pеrlatum |
10-47 |
83,4* |
33,4
|
10,5±0,8
|
61,0$ |
36,9 |
13,5±0,3§ |
|
Battarrea phalloides |
10-49 |
66,8*
|
16,8 |
10,0±0,8 |
44,0$
|
19,9 |
10,6±0,6
|
|
Dictyophora duplicate |
10-50 |
н.и.
|
н.и.
|
н.и. |
60,0$ |
35,9 |
10,8±0,5 |
|
Lycoperdon umbrinum |
10-54 |
н.и.
|
н.и.
|
н.и. |
35,0 |
10,9 |
10,0±0,6
|
|
Lycoperdon umbrinum |
10-58 |
49,8
|
- |
- |
40,0$
|
15,9 |
10,3±1,3
|
|
Тамифлю (контроль) |
- |
100,0* |
50,0 |
14,0# |
100,0$ |
75,9 |
14,0§ |
|
Контроль вируса (без препарата) |
- |
50,0 |
- |
9,2±1,0 |
24,1 |
- |
9,7±0,7 |
Примечание: М - среднее арифметическое, Sm - стандартное отклонение, n-число животных в группе; КЗ - коэффициент защиты; СПЖ - средняя продолжительность жизни; н.и. - не исследовали; * и $ - отличие от соответствующего контроля по критерию χ2; # и § - отличие от соответствующего контроля по U-критерию Манна-Уитни при p≤0,05.
Рецензенты:
- Трошкова Галина Павловна, д.б.н., профессор, заведующая сектором биохимии отдела профилактики и лечения ООИ, Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Кольцово.
- Белявская Валентина Александровна, д.б.н., профессор, заведующая сектором отдела научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями ООИ, Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Кольцово.