Введение. Важным направлением фармацевтической науки является синтез новых биологически активных веществ, обладающих высокой эффективностью и малой токсичностью. Перспективным направлением является поиск соединений в ряду цинхониновой кислоты, среди которых выявлены вещества с различной активностью. В настоящее время в медицине используется N-(5-диэтиламинопентил-2)-2-[21-(511-нитрофурил-211-винил]-4-хинолинкар-боксамид под названием хинифурил в качестве антимикробного средства в виде мази [9].
В ранее проведённых исследованиях нами осуществлён синтез замещенных амидов 2-хлор- [3] и 2-оксоцинхониновой кислоты [4]. Установлено, что некоторые из апробированных соединений при биологических испытаниях на животных обладают противовоспалительной или анальгетической активностью.
Целью исследования является синтез новых биологически активных соединений в ряду производных цинхониновой кислоты, изучение их физико-химических свойств, анализ результатов биологических испытаний, установление взаимосвязи структура-активность.
В продолжение предыдущих работ, а также с целью поиска новых биологически активных веществ, представляло интерес осуществить синтез новых амидов 2-хлорцинхониновой кислоты и использовать их для получения соответствующих амидов 2-оксоцинхониновой кислоты. Изучить свойства и биологическую активность целевых продуктов в сравнении с препаратами эталонами.
Материалы и методы исследования
Структура полученных соединений подтверждена спектральными методами анализа. ИК спектры сняты на приборах ИК-Фурье спектрофотометре (ФСМ-1201) и SPECORD М-80 (Германия) для пасты соединений в вазелиновом масле. ЯМР 1Н-спектры записаны на Фурье-спектрометре ЯМР Tesla BS-567А (100 МГц) в растворе ДМСО-d6, внутренний стандарт - ГМДС. Ход реакций и чистоту соединений контролировали методом ТСХ на пластинах Silufol UV-254 в системе изопропиловый спирт-ацетон-аммиак (3:2:1), пятна детектировали парами йода. Данные элементного анализа синтезированных веществ соответствуют вычисленным значениям. 2-Хлор- (I) и 2-оксоцинхониновая кислота (II) получены по известному в литературе методу [7]. Этиловый эфир 1,2-дигидро-1Н-2-оксоцинхониновой кислоты (III) получен по методу, приведенному в работе [11].
Биологические испытания синтезированных соединений проведены на мышах согласно «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологичес-ких веществ» [8] в сравнении с препаратами эталонами: диклофенаком натрия (ортофеном), ацетилсалициловой кислотой (аспирином) и метамизолом натрия (анальгином).
Общая методика получения замещенных амидов 2-хлорцинхониновой кислоты (1-7)
К 2,08 г (0,01 моль) 2-хлорцинхониновой кислоты (I) прибавляют 30-40 мл тионилхлорида и нагревают на водяной бане 3 часа. Избыток тионилхлорида отгоняют в вакууме, к охлажденной реакционной массе добавляют 0,01 моль раствора соответствующего амина в бензоле и 3-5 мл триэтиламина, затем нагревают на водяной бане в течение 1 часа. Бензол и летучие продукты отгоняют с водяным паром. Остаток обрабатывают 10 % раствором
NaHCO3, отфильтровывают и перекристаллизовывают соединения из диоксана. Выходы продуктов реакций составляют 71-92 %.
Общая методика получения замещенных амидов 1,2-дигидро-1Н-2-оксоцинхо-ниновой кислоты 8,10, 12-16 (метод А)
Смесь 0,01 моль амида 2-хлорцинхониновой кислоты и 10 мл 10% хлороводородной кислоты кипятят в течение 4 часов, охлаждают, выливают в холодную воду, нейтрализуют раствором аммиака. Выделившийся осадок отфильтровывают, промывают водой и перекристаллизовывают из ДМФА.
Общая методика получения замещенных амидов 1,2-дигидро-1Н-2-оксоцинхониновой кислоты 8-16 (метод Б)
Смесь 2,17 г (0,01 моль) этилового эфира 1,2-дигидро-2-оксоцинхониновой кислоты [11] и (0,01 моль) соответствующего алкил-, ариламина в 10 мл этиленгликоля, нагревают при 170-180 оС в течение 4 часов, охлаждают, разбавляют водой. Осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из ДМФА.
Таблица 1. Характеристики замещенных амидов 2-хлорцинхониновой кислоты (1-7)
|
Соеди- нение |
R |
Брутто-формула |
Т. пл., ОС |
Выход, % |
|
1 |
(СН2)2OH |
С12Н11CIN2O2 |
206-207 |
71 |
|
2 |
(СН2)3OH |
С13Н13CIN2O2 |
264-265 |
78 |
|
3 |
(СН2)2N(C2H5)2 |
С16Н21N3O2 |
246-248 |
81 |
|
4 |
CН2С6Н5 |
С17Н14N2O2 |
214-216 |
82 |
|
5 |
C6H4CH3-4 |
С17Н13CIN2O |
194-195 |
92 |
|
6 |
C6H4NHCOCH3-4 |
С18Н14CIN3O2 |
255-256 |
90 |
|
7 |
(СН2)15CH3 |
С26Н39CIN2O |
104-106 |
88 |
Таблица 2. Характеристики замещенных амидов 1,2-дигидро-1Н-2-оксоцинхониновой кислоты (8-16)
|
Соединение |
R |
Брутто- формула |
Т. пл., оС |
Выход, % |
Rf* |
|
|
Метод А |
Метод Б |
|||||
|
8 |
(СН2)2OH |
С12Н12N2O3 |
264-265 |
70 |
72 |
0,72 |
|
9 |
СН2СН=СН2 |
С13Н12N2O2 |
296-297 |
. . . |
80 |
0,87 |
|
10 |
(СН2)3OH |
С13Н14N2O3 |
264-265 |
71 |
78 |
0,76 |
|
11 |
С6Н11-цикло |
С16Н18N2O2 |
340-341 |
. . . |
75 |
0,85 |
|
12 |
(СН2)2N(C2H5)2 |
С16Н21N3O2 |
246-248 |
77 |
81 |
0,84 |
|
13 |
CН2С6Н5 |
С17Н14N2O2 |
311-312 |
68 |
73 |
0,65 |
|
14 |
C6H4CH3-4 |
С17Н14N2O2 |
340-341 |
63 |
75 |
0,68 |
|
15 |
C6H4NHCOCH3-4 |
С19Н17N3O3 |
>360 |
69 |
72 |
0,55 |
|
16 |
(СН2)15CH3 |
С26Н40N2O2 |
252-254 |
71 |
79 |
0,70 |
* в системе изопропиловый спирт-ацетон-аммиак (3:2:1)
Таблица 3. Спектральные характеристики синтезированных соединений
|
Соеди- нение |
R |
Спектры ЯМР Н1 (ДМСО-d6), δ, м.д.: |
|||
|
NHхин., с, 1Н |
NHамид, 1Н |
HetH, ArH, м |
Прочие |
||
|
8 |
(СН2)2OH |
11,75 |
8,58 т |
6,46-7,69 (5H) |
4,71т (1Н, СН2ОН) 3,50 к (2Н, СН2NH) 3,31 r (2H, CH2OH) |
|
9 |
СН2СН=СН2 |
11,77 |
8,81 т |
6,44-7,65 (5Н) |
5,82 м (1Н, СН=СН2) 5,19 д (2Н, СН=СН2) 3,92 т (2Н, NHCH2) |
|
10 |
(СН2)3OH |
11,74 |
8,56 т |
6,39-7,64 (5Н) |
4,42 т (2Н, СН2ОН) 3,44 к (2Н, NHCH2) 1,67 м (2Н, СН2ОН) |
|
11 |
С6Н11-цикло |
11,72 |
8,48 д |
6,35-7,62 (5Н) |
3,73 м (1Н, NHCH) 1,24-1,86 м (10Н, 5СН2 |
|
12 |
(СН2)2N(C2H5)2 |
11,74 |
8,51 т |
6,39-7,73 (5Н) |
3,31 к (2Н, NHCH2) 2,52 к (6Н, 3CH2) 0,97 т (6Н, 2СН3) |
|
13 |
CН2С6Н5 |
11,77 |
9,15 т |
6,46-7,65 (10Н) |
4,44 д (2Н, СН2) |
|
14 |
C6H4CH3-4 |
11,84 |
10,49 с |
6,57-7,69 (9Н) |
2,26 с (3Н,СН3) |
|
15 |
C6H4NHCOCH3-4 |
11,77 |
10,44 с |
6,52-7,62 (9Н) |
9,75 с (1Н, NHCOCH3) 1,25 с (3Н,СН3) |
|
16 |
(СН2)15CH3 |
11,59 |
8,55 т |
6,33-7,64 (5Н) |
1,44 к (2Н, NHCH2) 1,22 с (28Н, 14СН2) 0,84 т (3Н, СН3) |
Результаты и их обсуждение
В ходе проведенных опытов реакцией хлорангидрида 2-хлорцинхониновой кислоты с алкил-, ариламинами были получены соответствующие замещенные амиды 1-7 с выходами 71-92 %.
Исследования показали, что замещенные амиды 2-оксоцинхониновой кислоты 8-16 образуются при кипячении амидов с разбавленной хлороводородной кислотой (метод А) или при нагревании этилового эфира 2-оксоцинхониновой кислоты с алкил-, ариламинами в этиленгликоле (метод Б). Химические превращения показаны на схеме:
1-16 R = (СН2)2OH (1); R = (СН2)3OH (2); R = (СН2)2N(C2H5)2 (3); R = CН2С6Н5 (4);
R = C6H4CH3-4 (5); R = C6H4NHCOCH3-4 (6); R = (СН2)15CH3 (7); R = (СН2)2OH (8);
R = СН2СН=СН2 (9); R = (СН2)3OH (10); R = С6Н11-цикло (11); R =CH2N(C2H5)2 (12);
R = CН2С6Н5 (13); R = C6H4CH3-4 (14); R = NHСОСН3 (15); R = (СН2)15СН3 (16)
Полученные соединения 1-16 - это бесцветные кристаллические вещества, не растворимые в воде и растворимые при нагревании в диоксане и ДМФА (табл. 1, 2). Структура соединений подтверждена данными ИК- и ЯМР Н1-спектров.
ИК спектры амидов (1-7), снятые в вазелиновом масле, содержат полосы валентных колебаний ν, см-1: 1630-1660 (СО), 3140-3340 (NH-амид). В спектрах соединений 8-16 имеются
полосы при 1560-1672 карбонильных групп, NH-амидных групп и NH-хинолинового кольца при 3128-3228 см-1.
В спектрах ЯМР Н1 соединений 1-7 имеются сигналы протонов δ, м.д.: NH-амидной группы при 8,72-12,90, ароматических и гетероциклических протонов в области 7,27-8,83.
В спектрах соединений 8-16 (табл. 3) присутствуют сигналы протонов δ. м.д.: 6,32-7,73 группа линий ароматических и гетероциклических протонов (м, ArH, HetH); сигнал 8,48-10,49 (NH-амид), 11,59-11,84 (1Н, с, NH-хинолинового цикла).
Исходя из данных ЯМР Н1-спектров (ДМСО-d6) можно сделать заключение, что синтезированные соединения 8-16 существуют в оксо-форме в которых сигнал -NH- хинолинового цикла имеется в области 11,59-11,84 м. д., в данном растворителе.
Определена острая токсичность 2-оксоцинхониновой кислоты и полученных соединений по экспресс-методике Прозоровского В. Б. на белых мышах массой 22-24 г при внутрибрюшинном способе введения [6] в сравнении с ортофеном, аспирином и анальгином [2]. Установлено, что ЛД50 2-оксоцинхонининовой кислоты составляет > 600 мг/кг, а ЛД50 соединений 9 и 16 > 1000 мг/кг. Апробированные соединения менее токсичны, чем препараты сравнения - ортофен и аспирин (табл. 4).
Изучена противовоспалительная и анальгетическая активность 1,2-дигидро-1Н-2-оксо-цинхониновой кислоты и амидов 1,2-дигидро-1Н-2-оксоцинхониновой кислоты в сравнении с препаратами - эталонами: ортофеном [5], аспирином и анальгином.
Противовоспалительная активность (ПВА) соединений (II, 9, 16) и аспирина изучена на белых крысах обоего пола массой 180 - 220 г на каррагениновой модели воспаления, создаваемой субплантарным введением в заднюю лапу крыс 0,1 мл 1 % водного раствора каррагенина [7]. Предварительно измеряли исходный объем (мл) задней лапы опытных и контрольных крыс с помощью онкометра. Исследуемое вещество в дозе 25 мг/кг, а аспирин 50 мг/кг вводили внутрибрюшинно в 2 % крахмальной слизи за один час до моделирования воспаления. Прирост объёма воспалённой стопы оценивали онкометрически через 3 и 5 часов после введения флогогенного агента и вычисляли процент торможения отёка к контролю. Проведено 5 опытов в каждой группе было 6 животных. Результаты обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента, результаты считали достоверными при р < 0,05 [1].
Анальгетическая активность соединений (II, 9, 16) и анальгина изучена на модели «уксусных корчей» на беспородных белых мышах-самцах массой 22-24 г. Мышам внутрибрюшинно вводили 0,75 % водный раствор уксусной кислоты из расчета 0,25 мг на 10 г массы животного и подсчитывали количество корчей в течение 10 минут. Исследуемые вещества в дозе 25 мг/кг вводили внутрибрюшинно в виде взвеси в 2 % крахмальной слизи дозе за 30 мин до внутрибрюшинного введения уксусной кислоты, а препарат сравнения анальгин - в дозе 55 мг/кг, соответствующей ED50 по тесту «уксусных корчей» [10]. Результаты оценивали по способности тормозить количество корчей по сравнению с контрольными животными, получавшими растворитель. В каждой группе было по 5 мышей. Данные опытов обрабатывали статистически с вычислением критерия достоверности. Разницу считали достоверной при р < 0,05 [1].
Таблица 4. Острая токсичность, противовоспалительная и анальгетическая активность 2-оксо- (II) и амидов 1,2-дигидро-1Н-2-оксоцинхониновой кислоты (9,16)
|
Соединение/ препарат-эталон
|
ЛД50, мг/кг в/б
|
Противовоспалительная активность (ПВА), % торможения отека к контролю после введения флогогенного агента через |
Анальгетическая активность (АА)
|
|||
|
Доза, мг/кг в/б |
3 ч |
5 ч |
Доза, мг/кг в/б |
% уменьшения «уксусных корчей» |
||
|
II |
> 600 |
25 |
36,9*
|
38,0*
|
25 |
57,1**
|
|
9 |
> 1000 |
25 |
57,3* |
56,5* |
25 |
41,5**** |
|
16 |
> 1000 |
25 |
33,1*
|
35,0*
|
25 |
65,3**** |
|
Диклофенак нат-рия (ортофен) |
132
|
25 |
69,4*** |
72,2*** |
25 |
50,0*
|
|
Ацетилсалициловая кислота (аспирин) |
495 |
50 |
51,2* |
28,7*** |
. . . |
. . . |
|
Метамизол нат-рия (анальгин) |
2900 |
. . . |
. . . |
. . . |
55 |
50,6**** |
*-р <0,05; **-p 0,02; ***-р< 0,01; ****-р< 0,001 по сравнению с контролем.
Исследования показали, что апробированные соединения II, 9 и 16 при внутрибрюшинном пути введения в дозе 25 мг/кг проявляют противовоспалительное действие несколько ниже, чем ортофен в этой же дозе, и превышают активность аспирина в дозе 50 мг/кг (таблица 4).
Установлено, что апробированные соединения II, 9, 16 обладают анальгетической активностью в дозе 25 мг/кг и более активны, чем анальгин в дозе 55 мг/кг. Соединения II и 16 оказывают более сильное анальгезирующее действие, чем ортофен в дозах 25 мг/кг. Таким образом, в результате исследований получено 16 ранее неизвестных соединений, строение которых установлено спектральными методами. Некоторые из полученных соединений в опытах на животных показали наличие противовоспалительной и анальгетической активности.
Выводы
- В ходе проведенного исследования установлено, что соответствующие амиды 1,2-дигидро-1Н-2-оксоцинхониновой кислоты образуются при взаимодействии амидов 2-хлорцинхониновой кислоты с хлороводородной кислотой (методА) или при нагревании этилового эфира 2-оксоцинхониновой кислоты с алкил- или ариламинами в этиленгликоле (метод Б).
- На основании данных ИК-, ЯМР Н1-спектров установлено, что полученные соединения существует в оксо-форме.
- По результатам скрининга синтезированных соединений на животных выявлены вещества, обладающие противовоспалительной или анальгетической активностью при низкой токсичности.
Рецензенты:
- Хомов Ю. А., д. фарм. н., профессор, профессор каф. фармацевтической химии ФДПО и ФЗО ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития РФ, г. Пермь.
- Игидов Н. М., д. фарм. н., доцент, профессор каф. органической химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития РФ, г. Пермь.