На фоне неспецифического инфекционно-воспалительного процесса происходит накопление бактериальных липополисахаридов (ЛПС), цитокинов и свободных радикалов, оказывающих как прямое, так и опосредованное воздействие на гомеостаз железа, процессы эритропоэза и продукцию эритропоэтина, создавая тем самым условия для развития анемии хронических заболеваний [3].
Гепсидин - гормоноподобный пептид, регулирующий обмен железа, впервые был обнаружен и описан в 2001 году как антибактериальный пептид, способный повреждать мембрану бактерий. Впоследствии установлено, что гепсидин, являясь отрицательным регулятором абсорбции железа в кишечнике и его мобилизации из депо, оказывает тем самым основной биологический эффект, направленный на снижение железа в циркуляции [10]. Один из механизмов, приводящий к увеличению синтеза гепсидина и не зависящий от концентрации железа и активности эритропоэза, связан с воспалением и инфекцией. Бактериальные ЛПС и цитокины, воздействуя на синтез гепсидина, создают условия для перераспределения железа из циркуляции в депо и ограничения его доступности для микроорганизмов [5].
Пиелонефрит - неспецифический инфекционно-воспалительный процесс в тубулоинтестициальной зоне и чашечно-лоханочной системе почки. В этиологической структуре заболевания преобладают грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriaciae, имеющие общую структурную мембранную единицу в виде ЛПС, являющихся мощным активатором синтеза провоспалительных цитокинов [7]. Грамположительные микроорганизмы также имеют биологически активные молекулы клеточной стенки в виде пептидогликана, липотейхоевой кислоты, липопептидов, инициирующих воспалительный ответ и выработку цитокинов макрофагами [1]. Пиелонефрит сопровождается выраженными нарушениями цитокиновой сети и всех звеньев клеточного и гуморального иммунитета, что рассматривается как одно из условий персистенции бактерий и хронизации заболевания [7]. При этом цитокиновая активация синтеза гепсидина и накопление железа в энтероцитах, макрофагах и гепатоцитах при бактериальных инфекциях может привести к развитию анемии [5]. Хронизация воспаления, в свою очередь, способствует формированию и закреплению порочного круга дизрегуляции обмена железа и утяжелению анемии [6]. Изучение метаболизма железа при хроническом пиелонефрите (ХрПН) с использованием современных лабораторных тестов представляет особый интерес, поскольку анемия при этом заболевании может развиться на фоне достаточной функции почек и свидетельствовать о тяжести процесса [8].
Цель работы
Оценка микробиологического пейзажа мочи у больных ХрПН и изменений показателей иммуногенеза и обмена железа при бактериурии.
Материалы и методы
Нами обследовано 139 больных ХрПН, с длительностью заболевания от 1 года до 5 лет, без нарушения функции почек, в возрасте от 20 до 45 лет, средний возраст составил 34,4(5,1) года. Из них 78 пациентов (56,1 %) находились в фазе активного воспаления, 61 (43,9 %) - в фазе ремиссии. Основная масса пациентов была представлена женщинами - 104 человека (74,8 %), мужчин - 35 (25,2 %).
Обследование пациентов в фазе обострения заболевания проводилось в стационаре НУЗ «Дорожная клиническая больница на станции Саратов-2 ОАО «РЖД», в фазе ремиссии - в условиях поликлиники № 1 указанного лечебного учреждения, при посещении пациентами врача-терапевта с целью диспансерного наблюдения.
Критериями исключения явились: уролитиаз, ХПН, сахарный диабет, обострение сопутствующих хронических заболеваний внутренних органов, злокачественные новообразования, беременность.
Диагноз ХрПН, фаза заболевания, локализация, активность воспалительного процесса, функциональное состояние почек были верифицированы клиницистами, в соответствии с классификацией Н. А. Лопаткина, на основании общепринятых методов клинического обследования, включающие в себя анализ жалоб и анамнестических данных, проведение физикального, клинико-лабораторного и инструментальных (ультразвукового и рентгенологического) обследований.
Всем пациентам проведен комплекс специальных лабораторных исследований, направленный на оценку состояния эритропоэза - общий анализ крови; иммуногенеза - ИЛ-6, α-ФНО; феррокинетики - сывороточное железо (СЖ), ОЖСС, НТЖ, гепсидин (Гп). Бактериологическое исследование мочи и количественное определение степени бактериурии (числа микробных клеток в 1 мл мочи - КОЭ/мл) проводилось методом посева серийных разведений мочи на плотные питательные среды (5 % кровяной агар и агар хромогенный для уропатогенных бактерий, производства «Conda», Испания) в чашках Петри.
Общий анализ крови выполняли при помощи гематологического автоматического анализатора марки KX-21N (SYSMEX, Япония). Динамика биохимических показателей оценивалась с помощью программируемого фотометра марки CLIMA МС-15 (PALL, Испания), с использованием специальных наборов реагентов. Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили на автоматическом иммуноферментном анализаторе марки Alisei Q.S. (SEAC, Италия), с использованием тест-систем производства ООО «Компания АлкорБио», г. Санкт-Петербург и ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск. Для определения гепсидина в сыворотке крови использовали специальный набор без экстракции (Hepsidin-25 human), разработанный группой компаний «BCM», США, Cat. No. S-1337, для анализа образцов человеческой или крысиной сыворотки.
Статистическую обработку данных осуществляли на персональном компьютере с использованием программы Statistika 6.0. Проводилось предварительное тестирование количественных данных на нормальность распределения с помощью критериев Колмогорова - Смирнова, ассиметрии и эксцесса. Ассиметрично распределенные вариационные ряды описывали при помощи медианы (Ме) и интерквартильной широты (интервал значений между 25-м и 75-м процентилем распределения). При анализе непрерывных данных двух независимых выборок использовался непараметрический U-критерий Манна - Уитни [2]. Различие считалось достоверным при двустороннем уровне значимости р<0,05, р<0,01.
Результаты и обсуждения
Среди обследованных больных ХрПН бактериурия отмечалась у 73,4 % (102/139). В 26,6 % (37/139) случаев посев мочи роста не дал. В период обострения заболевания бактериурия наблюдалась у 82,1 % (64/78) больных, в 17,9 % (14/78) случаев возбудитель ИМП обнаружен не был. В период ремиссии - микроорганизмы были выделены из мочи в 62,3 % (38/61) случаев, у 37,7 % (23/61) пациентов моча оставалась стерильной.
Из мочи от 102 пациентов выделены 116 штаммов различных микроорганизмов, причем в 86,3 % (88/102) случаев высевался один возбудитель, в 13,7 % (14/102) наблюдались микробные ассоциации. С большей частотой регистрировалось сочетание E.coli и Enterococcus spp. - 43 % (6/14).
Основную долю среди выделенных микроорганизмов занимали грамотрицательные бактерии - 59,5 % (69/116), из них в основном E. Coli - 74 % (51/69), что подтверждает этиологическую значимость кишечной палочки для ИМП. Proteus mirabilis высевался в 10,3 % (12/116) случаев, и незначительная часть грамотрицательных бактерий была представлена Enterobacter spp. и Ps.aeruginosae - по 2,6 % (3/116) соответственно. Грампозитивная флора высевалась в 37 % (43/116) случаев, в том числе Enterococcus spp. 19 % (22/116), St. epiderm. 8,6 % (10/116), St.aureus 4,3(5/116), Streptococcus spp. 4,3 % (5/116), Corynebacterium spp. 0,9 % (1/116), что соответствует современным данным об увеличении роли грампозитивной микрофлоры в генезе ИМП [9]. В 3,5 % (4/116) случаев микрофлора мочи была представлена грибами рода Candida, что также не противоречит данным аналогичных исследований и указывает на рост грибковых инфекций мочевыводящих путей [4].
Таким образом, микрофлора, выделенная нами в результате микробиологического исследования мочи больных ХрПН, отличается достаточным разнообразием аэробных бактерий и во многом согласуется с данными результатов подобных исследований [9].
По результатам определения степени бактериурии больные были распределены на пять групп. Первая группа 26,6 % (37/139) - это пациенты, у которых в моче не наблюдалось роста микрофлоры (контрольная группа). Вторая 20,7 % (29/139) - c бактериурией 103 КОЭ/мл, третья 15.8 % (22/139) - с 104 КОЭ/мл, четвертая 18,7 % (26/139) - с 105 КОЭ/мл, пятая 18,2 % (25/139) - с 106 КОЭ/мл.
Всем пациентам выполнены специальные исследования и определены статистически значимые различия показателей для каждой группы с бактериурией, в сравнении с группой пациентов без бактериурии.
Характер распределения, полученных нами данных, явился определяющим фактором при выборе и использовании вида средней и показателя разброса.
В таблице 1 приведены результаты специальных исследований, выполненных для 139 больных ХрПН.
Таблица 1. Показатели эритропоэза, иммуногенеза и феррокинетики у больных ХрПН на фоне бактериурии различной степени, Ме (25-й;75-й процентили)
|
Показатель |
Роста нет (контрольная группа) (n=37) |
Бактериурия 103 КОЭ/мл (n=29) |
Бактериурия 104 КОЭ/мл (n=22) |
Бактериурия 105 КОЭ/мл (n=26) |
Бактериурия 106 КОЭ/мл (n=25) |
|
HGB, г/л |
133 (127;144) |
130 (121;137) ⃰ |
126 (118;139) ⃰ |
125 (115;139) ⃰ |
123 (113;136) ⃰ |
|
WBC, х109/л |
6,0 (5,5;7,2) |
6,9 (5,6;8,9) ⃰ |
7,1 (5,2;8,9) ⃰ |
7,6 (5,6;8,5) ⃰ |
8,7 (8,0;9,7) ⃰ |
|
СЖ, мкмоль/л |
18,6(15,2;20,2) |
12,4 (10,8;14,6) ⃰ ⃰ |
11,5 (8,8;15,1) ⃰ ⃰ |
10,2 (8,9;13,2) ⃰ ⃰ |
9,9 (7,7;16,2) ⃰ ⃰ |
|
ОЖСС, мкмоль/л |
56,2 (47,7;61,2) |
49,7.(42,3;55,1) ⃰ ⃰ |
47,1(36,2;52,3) ⃰ ⃰ |
47,4 (42,3;52,1) ⃰ ⃰ |
47,5 (39,9;56,2) ⃰ ⃰ |
|
НТЖ, % |
32,4 (28,9;36,5) |
24,6 (22,6;30,1) ⃰ ⃰ |
26,3 (22,8;33,3) ⃰ ⃰ |
21,8 (19,3;31,0) ⃰ ⃰ |
24,3 (17,7;29,3) ⃰ ⃰ |
|
ИЛ-6, пг/мл |
5,3 (2,5;8,1) |
9,9 (5,6;42,3) ⃰ |
19,2 (5,2;80,9) ⃰ ⃰ |
23,7 (5,5;114,2) ⃰ ⃰ |
24,7(5,8;110,2) ⃰ ⃰ |
|
α-ФНО,пг/мл |
5,6 (3,1;12,2) |
8,9 (5,7;20,8) ⃰ |
13,6 (6,8;86,9) ⃰ ⃰ |
29,8 (5,8;119,5) ⃰ ⃰ |
48,2 (6,8;122) ⃰ ⃰ |
|
Гп,пг/мл |
190 (120;245) |
280 (232;482) ⃰ |
364 (200;460) ⃰ ⃰ |
389 (260;500) ⃰ ⃰ |
412 (245;480) ⃰ ⃰ |
Примечание - уровень значимости - ⃰ p<0,05, ⃰ ⃰ p<0,01 по сравнению с контрольной группой, двусторонний непараметрический U-критерий Манна - Уитни.
ИЛ-6 и α-ФНО являются главными провоспалительными цитокинами, которые продуцируются в ответ на бактериальную инфекцию [7]. У больных ХрПН на фоне микробной колонизации почечной ткани и выраженного воспалительного процесса (повышенное количество лейкоцитов, p<0,05) наблюдается достоверно значимое повышение указанных цитокинов (p<0,05, p<0,01) по сравнению с группой пациентов, не имеющих бактериурию.
Уровень гепсидина изменяется параллельно колебаниям значений цитокинов - достоверно увеличивается (p<0,05, p<0,01) у больных с бактериурией, достигая максимальных значений в группе пациентов с бактериурией 105 - 106 КОЭ/мл. Гепсидин, как отрицательный регулятор обмена железа, увеличиваясь, приводит к уменьшению всасывания железа в кишечнике и, следовательно, способствует снижению концентрации гемоглобина [5]. У пациентов на фоне бактериурии различной степени отмечается достоверное снижение (p<0,05, p<0,01) биохимических маркеров феррокинетики - СЖ, ОЖСС, НТЖ и гемоглобина в сравнении с контрольной группой пациентов без бактериурии.
Выводы
Таким образом, обнаруженные нами изменения в уровне основных провоспалительных цитокинов, гепсидина, сывороточного железа и гемоглобина у больных ХрПН с сохраненной функцией почек свидетельствуют о нарушении регуляции иммуногенеза, гемопоэза и феррокинетики в ответ на внедрение бактериальных патогенов.
Рецензенты:
- Пучиньян Д. М., д.м.н., профессор, заместитель директора по науке ФГУ «Саратовский НИИ травматологии и ортопедии» Минздравсоцразвития РФ, г. Саратов.
- Луцевич И. Н., д.м.н., профессор, зав.кафедрой гигиены медико-профилактического факультета «Саратовского ГМУ им. В. И. Разумовского» Минздравсоцразвития РФ, г. Саратов.