Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ALLOCATION ORIGINATOR ASKOSFEROZ BEES AND HIS STUDYING KULTURALNO – MORPHOLOGICAL PROPERTIES

Shevchenko E.V. 1
1 FGBOU VPO "Omsk State Agrarian University, PA Stolypin, "Omsk, Russia (644122, Omsk, ul. October, 92)
4694 KB
Аuthor carried out pilot studies on allocation culture a mushroom Ascosphaera apis. Hyphas mycelium mushroom – branched-out, septirovanny, colourless, multinuclear cells. Mycelium in places contact lets out short lateral hyphas on which multinuclear structures gametangiya (genitals) which have not been differentiated on gametes (sex cells) are formed. Each gametangiya separates from hypha septum. Female and a man´s gametangiya differ on size: man´s it is less, it pours contents (cores and protoplasm) in larger (female). After contents merge gametangiya there is karyogamy (merge kernels), it is followed by multiple division kopulyatsionny kernels. In нутрио-ците, being the main, fast-growing nutritious part female gametangiya, round the formed kernels occurs formation large number spores which have been stuck together in compact masses – sporous balls which sometimes call expert-kami or bags. Mature (capsule spherical form) is called as tsisty or sporotsi-stand, with sporous balls has dark brown olive-brown color, with age blackens. Sizes sporous tsist and dispute are established, subspecies mushroom Ascosphaera apis are also established: Ascosphaera apis var. аpis.
culture Ascosphaera apis
sporous tsist
microphotographing
Введение. Благодаря хорошей приспособляемости к различным условиям внешней среды микроскопические грибы успешно выдерживают конкуренцию с другими микроорганизмами и часто вытесняют их с того или иного субстрата. На данный момент известно более 500 тысяч видов микроскопических грибов, большинство которых представлено сапрофитами. Около 50 видов являются патогенными. Патогенные грибы многочисленные, а вызываемые ими заболевания человека, животных и насекомых разнообразны. Патогенными для медоносной пчелы являются грибы родов Ascosphaera, Mucor, Rhisopus, Aspergillus.

Стрессовые факторы, физические, химические, биологические, экстремальные температуры и высокая влажность, загрязнение окружающей среды, отравление пестицидами, бесконтрольное применение антибиотиков, паразитарные инвазии - вызывают снижение резистентности организма насекомого к микозам, нарушая иммунную систему, защитные барьеры оболочек тела, пищеварительного тракта, трахей и способствуя развитию грибковой инфекции [1; 2].

Из микозов, патогенных для пчел, значительное распространение повсеместно получил известковый расплод - аскосфероз. В пятидесятых годах прошлого столетия аскосфероз был зарегистрирован в США и Канаде на пчелах - листорезах и одиночных пчелах Antrophora pacifica, а уже через десять лет имел широкое распространение на пасеках мира.

Заболевание чаще наблюдается в активный период жизнедеятельности пчелосемьи, при наличии расплода. Заражение пчел грибами начинается с прорастания спор. Инвазивная гифа проникает через кутикулу механически и энзиматически, попадает в гемоцель, где быстро развивается и прорастает. Иногда заражение может начинаться от заглоченных спор грибов, которые прорастают в кишечнике. Вначале поражаются трутневые личинки. Из спор прорастает мицелий, который постепенно поражает все органы и ткани насекомого, прорастает на поверхность, покрывая головной конец личинки войлочным налетом [2; 3; 5].

Цель исследований: выделить чистую культуру гриба Ascosphaera apis.

Для этого необходимо:

  • изучить и дифференцировать с помощью электронной микроскопии два подвида этого гриба Ascosphaera apis var. apis, A. apis var. major, отличающихся размерами споровых цист и спор;
  • дифференцировать полученную культуру гриба путем микроскопического и микологического исследований, имея в виду аспергиллез и возможность развития на перге гриба Battsia alvei (Ascosphaera).

Материалы и методы

При проведении исследований использовались методические указания по лабораторной диагностике аскосфероза пчел и выделению возбудителя из пыльцы (перги); утвержденные 9 апреля 1986 года [4].

В исследованиях использовали следующие материалы:

  • образцы сотов (соты) размером 10×15 см с больными и погибшими личинками, куколками;
  • предметное стекло, 50%-ный водный раствор глицерина для микроскопического исследования. Исследование проводили при малом увеличении микроскопа (7×10);
  • питательная среда - агар Сабуро для получения чистой культуры гриба из патологического материала;
  • микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на микроскопе Axio Scope 40 (Carl Zeiss) и Axio Star (Carl Zeiss) с встроенным ТV-адаптером и цифровой видеокамерой Carl Zeiss Imager, A1, окуляр W-PI 10x/23, объективы: Achroplan 20х/0,45, 40x/0,60, 63x/0,80 и 100x/1,25 oil.

Микрофотосъемку гистологических препаратов проводила кандидат ветеринарных наук М.Н. Гонохова. ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина», Омск, Россия (644122, г. Омск, ул. Октябрьская, 92).

Результаты исследований и их обсуждение

Для получения чистой культуры гриба из патологического материала (1-2 трупов пораженных личинок и 10%-ной эмульсии пыльцы (перги) на стерильном физиологическом растворе) делали посев на питательную среду агар Сабуро.

Рис. 1. Посев на питательную среду агар Сабуро.

Перед посевом питательный агар расплавляли в водяной бане и после охлаждения до 45-50 °С добавляли в него антибиотики (пенициллин 50 ЕД и стрептомицин 100 ЕД на 1 мл среды) для подавления сопутствующей бактериальной микрофлоры.

Пораженные личинки извлекали из ячеек, помещали в стерильную чашку Петри, разламывали их с помощью препаровальной иглы. Затем частицы размером не более 1 мм и эмульсию пыльцы помещали при помощи бактериологической петли в чашки Петри с одной из питательных сред в 3-5 точек (по одной частице в каждую точку). Посевы выдерживали при 26-30 °С и наблюдали за ними в течение 10 сут., имея в виду, что в процессе развития гриба на поверхности среды на 3-5-е сут. появляются белые пушистые колонии, которые в дальнейшем могут приобретать вид зеленовато-серого, войлокообразного налета.

Рис. 2. культура гриба Ascosphaera apis.

Чистую культуру гриба Ascosphaera apis получили путем дополнительного пересева культуры с периферии колоний, характерных для данного гриба.

Рис. 3. Пересев культуры гриба Ascosphaera apis.

Мазки из культуры исследовали под микроскопом. При положительном результате обнаружили многоклеточный септированный мицелий с многоядерными клетками, ветвистые гифы, споровые шары, которые, в свою очередь, заключены в шаровидную цисту. Споры мелкие, эллиптические, гладкие.

Рис. 4. В поле зрения гифы, споровые цисты.

Встречаются два подвида этого гриба: Ascosphaera apis var. Apis и Ascosphaera apis var. major, отличающиеся размерами споровых цист и спор.

Ascosphaera apis var. apis имеет размеры спор 3-3,8 × 2,3 мкм и диаметр споровых цист 32-99 мкм (в среднем 65,8 мкм), а A. apis var. major имеют размеры спор 3,3-4,2 × 2,5 мкм и диаметр споровых цист 88.4-168 мкм (в среднем 128,4 мкм).

Рис. 5. В поле зрения немногочисленные споровые цисты Ascosphaera apis var. apis. Размер споровых цист 39,41 мкм.

Одновременно дифференцировали полученную культуру гриба (аспергиллез) и возможность развития на перге гриба Battsia alvei (Ascosphaera), отличающегося от возбудителя аскосфероза пчел тем, что он не поражает расплод пчелиных семей, а часто поражает ячейки с пыльцой (пергой) осенью и весной, так как лучше растет при температуре до 20 °С. Гриб Battsia alvei не образует внутри спороцисты споровых шаров, и аскоспоры лежат свободно в спороцисте.

Лабораторный диагноз на аскосфероз устанавливали на основании положительных результатов микроскопического и микологического исследований.

Срок лабораторного исследования до 10 дней. При выделении из пыльцы (перги) гриба Ascosphaera apis ее нельзя использовать в качестве белковой подкормки пчелиным семьям.

Выводы

Из микозов, патогенных для пчел и наносящих большой ущерб пчеловодству на пасеках Омской области, получил распространение известковый расплод - аскосфероз.

В ходе проведенных исследований:

  1. выделена культура гриба Ascosphaera apis;
  2. изучены и дифференцированы с помощью электронной микроскопии два подвида этого гриба Ascosphaera apis var. apis, Ascosphaera apis var. мajor;
  3. дифференцирована полученная культура гриба путем микроскопического и микологического исследований (аспергиллез) и возможность развития на перге гриба Battsia alvei (Ascosphaera).

Рецензенты

  • Рудаков Н.В., д.мед.н., профессор, директор Омского научно-исследовательского института природноочаговых инфекций, г. Омск.
  • Бажин М.А., д.вет.н., профессор Всероссийского НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозакадемии, г. Омск.