Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

SELECTION OF THE MICROORGANISMS ASSOCIATION FOR BIO DESTRUCTION OF SOLID ALKANES FRACTION AT LOW POSITIVE TEMPERATURES

Alekseev A.Yu. 1, 2 Smorodina E.A. 2 Adamenko L.S. 2 Emelyanova E.K. 3, 2 Zabelin V.A. 4 Ilicheva T.N. 1, 2 Reznikov V.A. 1 Shestopalov A.M. 1, 2
1 Novosibirsk State University
2 State Research Center of Virology and Biotechnology VECTOR
3 Novosibirsk State Medical University
4 Join Stock Company Biooil
Oil – destructing microorganisms were isolated from the natural substrates originating from oil producing regions on the north part of western Siberia. The resulting bacteria were identified as Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Bacillus sp., Enterobacter sp. N-alkanes with a chain length of C17 - C39 can be utilized (degradated) by this microorganisms at low temperatures. The degree of degradation of individual bacterial strain was 77 - 83%, the association of strains - 89.8% within 28 days of cultivation in the laboratory. For evaluating temperature-dependence of solid alkanes bio destruction speed and degree by microorganisms a series of experiments at different temperatures (+4 ºС ¬- +8 ºС) were settled. the results of these experiments showed that bio destruction of solid alkanes is 5-11% more effective at +8 ºС then at +4 ºС. So selected bacteria association can be recommended for usage as oil destructing agent in a conditions of northern lands, handling barrels and other vessels used for long termed oil storage.
microorganisms-destructors
biodestructors
bioremediation
oil
Острой экологической проблемой территорий России (особенно северных) являются разливы нефти. Главные потенциальные источники загрязнения природной среды нефтью и нефтепродуктами  -  это нефтепромыслы, нефтепроводы, нефтеперерабатывающие предприятия, нефтехранилища, наземный и водный транспорт, перевозящий нефтепродукты. На нефтепромыслах, кроме эксплуатационных и разведочных скважин, имеются и другие источники загрязнения: трубопроводы, сборные пункты, хранилища, пункты подготовки нефти. В зависимости от положения нефтепромысла в ландшафтно-геохимической системе потоки нефти и нефтяных вод могут захватывать и смежные территории. Нефтепродукты обнаруживаются даже в областях, свободных от хозяйственной деятельности человека (заповедниках, труднодоступных территориях), т. к. транспортируются воздушными и водными потоками [3].

Проблема загрязнения окружающей среды нефтью особенно актуальна для Сибири (в частности, Ямало-Ненецкого и Ханты-Мансийского автономных округов), где располагается основной нефтегазоносный район России.

Значительная часть Пуровского и Надымского районов Ямало-Ненецкого автономного округа (ЯНАО) занята природными ландшафтами различной степени нарушенности вследствие обустройства месторождений и размещения вспомогательных объектов, городской инфраструктуры, вахтовых поселений.

В природно-климатических условиях ЯНАО в результате нефтяных разливов изменяются тепловые и физические свойства почвы, нарушается почвенный режим промерзания - оттаивания, чрезвычайно медленно протекает самовосстановление экосистем, что провоцирует ускорение эрозионных процессов. Отмечается большая неоднородность распределения нефтяных компонентов в почвах разных участков нефтепромыслов, что зависит от физических и химических свойств конкретных почв, качества и состава поступившей нефти. В результате этого условия самоочищение окружающей среды от токсичных органических веществ техногенного происхождения в ландшафтных зонах и областях различны [4]. Опасность остаточного накопления нефтепродуктов возрастает с юга на север.

 Самоочищение почво-грунтов и водоемов от нефтезагрязнений с помощью эндогенной углеводородокисляющей микробиоты происходит с небольшой скоростью и лимитируется неблагоприятными факторами (низкими среднегодовыми температурами, недостатком аэрации, отсутствием необходимого количества биогенных элементов и др.). Кроме того, характерной чертой северных экосистем является небольшая мощность гумусового горизонта, низкая биологическая активность почв, относительная обедненность видового состава растений, микроорганизмов и почвенных животных. Поэтому процессы биодеструкции нефтепродуктов и других загрязнителей заторможены и носят кратковременный характер [1, 4].

В местах проложенных трубопроводов разливы нефти повторяются регулярно. Временной мерой к устранению видимого нефтяного загрязнения является засыпка песком или торфом, являющаяся впоследствии не эффективной, поскольку нефть, поднимаемая грунтовой или дождевой водой, все равно всплывает на поверхность. При засыпке загрязнения торфом происходит захоронение и консервация тяжелых фракций нефти в нижележащих обводненных слоях торфа, где наблюдаются низкие температуры и нехватка свободного кислорода. При этом деструкции нефти аборигенной микробиотой почти не происходит, и отсутствуют физико-химические факторы разложения (солнечное излучение, ферменты микроорганизмов, растений и окислительные химические соединения) [2].

На данный момент известно множество видов микроорганизмов-нефтедеструкторов, которые входят в состав биопрепаратов, широко применяющихся для ликвидации аварийных разливов нефти и нефтепродуктов. Не вызывает сомнения, что с помощью микробиоты происходит полное разложение всех фракций нефти, в том числе и парафинов (твердых алканов). В связи с этим, существует реальная необходимость и возможность успешного проведения поисковой работы по выделению, изучению способностей и потенциала деструкции парафинов природными микроорганизмами - деструкторами нефти и нефтепродуктов.

Целью работы являлось исследование деструкции предельных углеводородов микроорганизмами, выделенными из северных районов нефтедобычи, при пониженных положительных температурах.

Материал и методы исследования

В районах нефтедобычи ЯНАО были взяты образцы воды, почвы, техногенного грунта и отсыпки для изучения микробного разнообразия из следующих экосистем: сосняк зеленомошный, верховое болото (мохово-кустарничковое), верховое болото (осоково-пушициевое), сосново-березовый смешанный лес, песчаная отсыпка. Образцы с загрязненных нефтью территорий включали в себя торф, воду болот, донные отложения, грунтовую воду, песок, почву верхних, средних и граничащих с мерзлотой горизонтов.

Для выделения штаммов-нефтедеструкторов образцы природных субстратов инкубировали в жидкой селективной питательной среде 8Е (г/л): (NH4)2HPO4 - 1.5; KH2PO4 - 0.7; MgSO4 x 7H2О - 0.8; NaCl - 0.5; pH 7.2  с добавлением нефти по весу (до 2 %) на качалке при температуре +8-10 ºС; затем полученные накопительные культуры переносили на агаризованную среду для получения чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов.

Морфологические признаки полученных изолятов-деструкторов изучали с помощью световой микроскопии живых и окрашенных клеток с использованием микроскопа Carl Zeiss Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия).

Оценку способности микроорганизмов к деструкции нефти осуществляли в жидкой питательной среде с добавлением нефти месторождений Западной Сибири в качестве единственного источника углерода. Биоэмульгирующие и биодеградирующие способности микроорганизмов оценивали визуально и с помощью газовой хроматографии. Первичная биодеградация нефти в пробирках оценивалась по следующим параметрам: разбиванию поверхностной пленки нефти, помутнению питательной среды за счет роста биомассы, образованию однородной эмульсии нефти в среде, газообразованию.

Выбор эффективных штаммов-деструкторов осуществляли по результатам хроматографических исследований и способности к росту и утилизации нефти при температуре 4-8º С.  

Чистые культуры микроорганизмов-деструкторов исследовали на наличие ферментативных свойств: протеолитической, амилолитической, желатиназной, каталазной, цитратной, оксидазной активности, способности к сбраживанию углеводов. Идентификацию штаммов бактерий осуществляли по определителю Берджи [6].

Косвенные признаки патогенности выявляли после постановки теста на наличие гемолизиса на кровяном агаре, фибринолитических и плазмокоагулирующих свойств с цитратной кроличьей плазмой. 

Эксперименты с деструкцией нефти в почве  производились в пластиковых контейнерах при температурах 8 ºС и 4 ºС в течение 28 сут. Содержание нефти в почве составляло 10 % по весу. При этом на 1 г почвы вносилось 106 КОЕ чистой культуры. 

Количественное определение содержания предельных углеводородов в образцах проводили методом капиллярной газовой хроматографии на приборе Varian 3600, оснащенном колонкой J&W Scientific DB-5, 30 м. х 0.22 мм, инжектором с делением потока (темп. 320 ºС), пламенно-ионизационным детектором (темп. 335 ºС), системой регистрации и обработки хроматографических данных (ChromStar, Bruker). В ходе анализа программировали изменение температуры колонки: 50 ºС - 2 мин , 50 ºС - 320 ºС - 15 ºС /мин , 320 ºС - 5 мин. Отнесение хроматографических пиков выполняли по времени удерживания с использованием калибровочного образца Boiling Point Calibration Sample #1, «ULTRA Scientific, Inc.», США.

Результаты исследования и их обсуждение

Из природных загрязненных нефтью субстратов были выделены 13 чистых культур микроорганизмов, обладающих способностью к активному росту на селективных питательных средах с нефтью.

На основе анализа литературных данных можно сделать вывод, что наиболее распространенными в загрязненных нефтью местообитаниях являются бактерии, а именно представители родов Rhodococcus, Arthrobacter, Acinetobacter. Micrococcus, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus [5, 7, 8, 9, 10]. В хронически загрязненных экосистемах безусловным доминантом являются родококки. Углеводородокисляющие дрожжи и мицелиальные грибы в загрязненных водных экосистемах занимают второстепенное место.

Таксономическая принадлежность природных изолятов, наиболее эффективно утилизировавших нефть по результатам визуального контроля, определена к родам Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Bacillus sp., Enterobacter sp., что согласуется с литературными данными. У этих штаммов были исследованы морфологические, биохимические и физиологические свойства (табл. 1). Косвенные признаки патогенности не выявлены.

Таблица 1. Биохимические свойства штаммов-деструкторов нефтепродуктов

№ штамма/

свойства

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

 

Acinetobacter sp. №1

Pseudomonas sp. ТЕТР-1-кр

Pseudomonas sp. Гос №2

Pseudomonas sp. №8

Acinetobacter  sp. Ставр 6

Enterobacter  sp. ГАВ 2-гл

Rhodococcus  sp. ГАВ 2-мат

Bacillus sp. №3

Bacillus sp. №5

Pseudomonas sp. ТЕТР -1-мел

Acinetobacter sp. №4

Bacillus sp. №2в

Acinetobacter sp. №7

Окрашивание по Граму

Гр-

Гр-

Гр-

Гр-

Гр-

Гр-

Гр+

Гр+

Гр+

Гр-

Гр-

Гр+

Гр-

Разжижение желатина

-

+

+

+

-

+

-

-

-

+

-

-

-

Протеолиз (казеинолитическая активность)

-

-

+

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

Каталазная активность

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Амилолитическая активность

-

-

-

+/-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Оксидазная активность

-

+

+

+

+

-

-

+

+

+

-

+/-

-

Реакция с метиловым красным

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Цитратная активность

-

+

+

+

-

+

+

+

+

+

-

+

-

Плазмокоагулазная активность

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Фибринолитическая активность

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Гемолитическая активность

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Выделенные тринадцать наиболее эффективных штаммов-деструкторов были внесены в емкости с загрязненной высокопарафинистой нефтью почвой с целью выяснения степени ее деструкции, а также разложения н-алканов. В результате было показано, что все штаммы деградируют за 4 недели до 69,4-89,9 % нефти. Количество предельных углеводородов твердой фракции (С17-С39) при этом снижалось на 60,7-84,9 % (табл. 2). Лучшие результаты по деструкции твердых алканов были показаны у штаммов 2, 4, 6, 12, 13, которые были объединены в микробную ассоциацию ДТА-1.

Таблица 2. Остаточное количество предельных углеводородов в образцах почвы после культивирования со штаммами микроорганизмов

Наименование образца

Остаточное количество нефтепродуктов

Остаточное количество предельных углеводородов С17-С39

Сумма, мг/10 г

Сумма, %

Сумма, мг/10 г

Сумма, %

контроль

880,45

100

442,74

100

1

269,76

30,64

174,13

39,33

2

120,37

10,25

71,74

16,20

3

224,54

25,50

163,13

36,85

4

102,6

11,65

84,63

19,11

5

205,67

23,36

138,79

31,35

6

91,41

10,38

74,89

16,92

7

148,22

16,83

125,22

28,28

8

170,19

19,33

122,78

27,73

9

185,23

21,04

167,43

37,82

10

131,7

14,96

123,9

27,98

11

226,77

25,76

216,44

48,89

12

108,7

10,12

66,69

15,06

13

112,75

12,81

101,72

22,98

Ассоциация

ДТА-1

-

-

45,18

10,20

Полученная ассоциация из 5 штаммов ДТА-1 была изучена на способность к деструкции нефтяной фракции твердых алканов при низких положительных температурах. Степень деструкции твердых алканов С17-С39 ассоциацией ДТА-1 составила 89,8 %.

Для определения влияния температуры на скорость и степень деструкции твердых алканов штаммами микроорганизмов-деструкторов нефти проведены сравнительные эксперименты при разных температурах (+4 ºС и +8 ºС). В целом, нужно отметить, что температура культивирования влияет только на скорость деструкции. При температуре +4 ºС степень деструкции твердых алканов на 5-11 % ниже по сравнению со степенью деструкции при температуре +8 ºС.

Заключение

Проведенные эксперименты показали наличие высокоэффективной нефтеразлагающей аборигенной микробиоты в местах разливов нефти в ЯНАО. Выделенные микроорганизмы способны к деструкции многих компонентов нефти, в т.ч. твердых алканов. Наиболее эффективные биодеструкторы были объединены в ассоциацию бактериальных штаммов ДТА-1, которая может быть рекомендована для разработки препарата, направленного для очистки загрязненных нефтью территорий в условиях севера, а также обработки цистерн и др. емкостей, длительное время используемых для хранения нефтепродуктов.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (ГК № 16.512.11.2160).

Рецензенты:

  • Беднаржевский С.С., д.т.н., профессор, заведующий кафедрой «Безопасность жизнедеятельности» Сургутского государственного университета,. г. Сургут.
  • Загребельный С.Н., д.б.н., профессор кафедры химии окружающей среды Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», г. Новосибирск.