Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ПОДБОР АССОЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ–ДЕСТРУКТОРОВ НЕФТЯНОЙ ФРАКЦИИ ТВЕРДЫХ АЛКАНОВ ПРИ НИЗКИХ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ

Алексеев А.Ю. 1, 2 Смородина Е.А. 2 Адаменко Л.С. 2 Емельянова Е.К. 3, 2 Забелин В.А. 4 Ильичева Т.Н. 1, 2 Резников В.А. 1 Шестопалов А.М. 1, 2
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»
2 Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
3 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский государственный медицинский университет"
4 Закрытое акционерное общество «Биоойл»
Из природных субстратов районов нефтедобычи севера Западной Сибири выделены микроорганизмы-деструкторы нефти, способные утилизировать твердые н-алканы с длиной цепи С17 – С39 при низких температурах. Полученные микроорганизмы идентифицированы как Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Bacillus sp., Enterobacter sp. Cтепень деструкции нефти отдельными штаммами составила 77 – 83 %, ассоциацией штаммов – 89,8 % в течение 28 сут культивирования в лабораторных условиях. Для определения влияния температуры на скорость и степень деструкции твердых алканов штаммами микроорганизмов-деструкторов нефти проведены сравнительные эксперименты при разных температурах (+4 ºС и +8 ºС). При температуре +4 ºС степень деструкции твердых алканов на 5-11 % ниже по сравнению со степенью деструкции при температуре +8 ºС. Подобранная ассоциация бактериальных штаммов может быть рекомендована для разработки препарата, направленного для очистки загрязненных нефтью территорий в условиях севера, а также обработки цистерн и др. емкостей, длительное время используемых для хранения нефтепродуктов.
микроорганизмы-деструкторы
биодеструкторы
биоремедиация
нефть
1. Алексеев А.Ю., Забелин В.А., Куц С.А., Пушкарев Н.С. Практика биологической рекультивации // Нефтяное хозяйство. - 2006. - №12. - С. 98-99.
2. Алексеев А.Ю. Не навреди // Промышленность и экология Севера. - 2011. №5-6 (13-14). - С. 40-47.
3. Андерсон Р.К., Мукатанов А.Х., Бойко Т.Ф. Экологические последствия загрязнения почв нефтью // Экология. - 1980. - №6. - С. 21-26.
4. Восстановление земель на Крайнем Севере. Ред. Арчегова И.Б. Коми научный центр УрО РАН, Сыктывкар, 2000. - 152 с.
5. Мокеева А.В., Алексеев А.Ю., Емельянова Е.К., Забелин В.А., Заушинцена А.В., Тараканова А.С., Шестопалов А.М., Ильичева Т.Н. Ассоциация штаммов бактерий-нефтедеструкторов для ремедиации нефтезагрязненных территорий // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2011. - Т. 9, № 3. - С. 27-34.
6. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. М.: Мир, 1997.
7. Balba M. T., Al-Awadhi N., Al-Daher R. Bioremediation of oil-contaminated soil: microbiological methods for feasibility assessment and field evaluation // Journal of Microbiological Methods. - 1998. - V. 32. - No. 2. - P. 155-164.
8. Joo H.-S., Ndegwa P. M., Shoda M., Phae Ch.-G., Bioremediation of oil-contaminated soil using Candida catenulata and food waste. // Environmental Pollution. - 2008. - V. 156. - No. 3. - P. 891-896.
9. Ghazali F.M., Rahman R.N., Salleh A.B., Basri M., International Biodegradation of hydrocarbons in soil by microbial consortium. // Biodeterioration & Biodegradation. - 2004 - V. 54. - No. 1. - P. 61-67
10. Rahman K. S. M., Thahira-Rahman J., Lakshmanaperumalsamy P., Banat I. M., Towards efficient crude oil degradation by a mixed bacterial consortium. // Bioresource Technology. - 2002. - V. 85. - No. 3. - P. 257-261.
Острой экологической проблемой территорий России (особенно северных) являются разливы нефти. Главные потенциальные источники загрязнения природной среды нефтью и нефтепродуктами  -  это нефтепромыслы, нефтепроводы, нефтеперерабатывающие предприятия, нефтехранилища, наземный и водный транспорт, перевозящий нефтепродукты. На нефтепромыслах, кроме эксплуатационных и разведочных скважин, имеются и другие источники загрязнения: трубопроводы, сборные пункты, хранилища, пункты подготовки нефти. В зависимости от положения нефтепромысла в ландшафтно-геохимической системе потоки нефти и нефтяных вод могут захватывать и смежные территории. Нефтепродукты обнаруживаются даже в областях, свободных от хозяйственной деятельности человека (заповедниках, труднодоступных территориях), т. к. транспортируются воздушными и водными потоками [3].

Проблема загрязнения окружающей среды нефтью особенно актуальна для Сибири (в частности, Ямало-Ненецкого и Ханты-Мансийского автономных округов), где располагается основной нефтегазоносный район России.

Значительная часть Пуровского и Надымского районов Ямало-Ненецкого автономного округа (ЯНАО) занята природными ландшафтами различной степени нарушенности вследствие обустройства месторождений и размещения вспомогательных объектов, городской инфраструктуры, вахтовых поселений.

В природно-климатических условиях ЯНАО в результате нефтяных разливов изменяются тепловые и физические свойства почвы, нарушается почвенный режим промерзания - оттаивания, чрезвычайно медленно протекает самовосстановление экосистем, что провоцирует ускорение эрозионных процессов. Отмечается большая неоднородность распределения нефтяных компонентов в почвах разных участков нефтепромыслов, что зависит от физических и химических свойств конкретных почв, качества и состава поступившей нефти. В результате этого условия самоочищение окружающей среды от токсичных органических веществ техногенного происхождения в ландшафтных зонах и областях различны [4]. Опасность остаточного накопления нефтепродуктов возрастает с юга на север.

 Самоочищение почво-грунтов и водоемов от нефтезагрязнений с помощью эндогенной углеводородокисляющей микробиоты происходит с небольшой скоростью и лимитируется неблагоприятными факторами (низкими среднегодовыми температурами, недостатком аэрации, отсутствием необходимого количества биогенных элементов и др.). Кроме того, характерной чертой северных экосистем является небольшая мощность гумусового горизонта, низкая биологическая активность почв, относительная обедненность видового состава растений, микроорганизмов и почвенных животных. Поэтому процессы биодеструкции нефтепродуктов и других загрязнителей заторможены и носят кратковременный характер [1, 4].

В местах проложенных трубопроводов разливы нефти повторяются регулярно. Временной мерой к устранению видимого нефтяного загрязнения является засыпка песком или торфом, являющаяся впоследствии не эффективной, поскольку нефть, поднимаемая грунтовой или дождевой водой, все равно всплывает на поверхность. При засыпке загрязнения торфом происходит захоронение и консервация тяжелых фракций нефти в нижележащих обводненных слоях торфа, где наблюдаются низкие температуры и нехватка свободного кислорода. При этом деструкции нефти аборигенной микробиотой почти не происходит, и отсутствуют физико-химические факторы разложения (солнечное излучение, ферменты микроорганизмов, растений и окислительные химические соединения) [2].

На данный момент известно множество видов микроорганизмов-нефтедеструкторов, которые входят в состав биопрепаратов, широко применяющихся для ликвидации аварийных разливов нефти и нефтепродуктов. Не вызывает сомнения, что с помощью микробиоты происходит полное разложение всех фракций нефти, в том числе и парафинов (твердых алканов). В связи с этим, существует реальная необходимость и возможность успешного проведения поисковой работы по выделению, изучению способностей и потенциала деструкции парафинов природными микроорганизмами - деструкторами нефти и нефтепродуктов.

Целью работы являлось исследование деструкции предельных углеводородов микроорганизмами, выделенными из северных районов нефтедобычи, при пониженных положительных температурах.

Материал и методы исследования

В районах нефтедобычи ЯНАО были взяты образцы воды, почвы, техногенного грунта и отсыпки для изучения микробного разнообразия из следующих экосистем: сосняк зеленомошный, верховое болото (мохово-кустарничковое), верховое болото (осоково-пушициевое), сосново-березовый смешанный лес, песчаная отсыпка. Образцы с загрязненных нефтью территорий включали в себя торф, воду болот, донные отложения, грунтовую воду, песок, почву верхних, средних и граничащих с мерзлотой горизонтов.

Для выделения штаммов-нефтедеструкторов образцы природных субстратов инкубировали в жидкой селективной питательной среде 8Е (г/л): (NH4)2HPO4 - 1.5; KH2PO4 - 0.7; MgSO4 x 7H2О - 0.8; NaCl - 0.5; pH 7.2  с добавлением нефти по весу (до 2 %) на качалке при температуре +8-10 ºС; затем полученные накопительные культуры переносили на агаризованную среду для получения чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов.

Морфологические признаки полученных изолятов-деструкторов изучали с помощью световой микроскопии живых и окрашенных клеток с использованием микроскопа Carl Zeiss Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия).

Оценку способности микроорганизмов к деструкции нефти осуществляли в жидкой питательной среде с добавлением нефти месторождений Западной Сибири в качестве единственного источника углерода. Биоэмульгирующие и биодеградирующие способности микроорганизмов оценивали визуально и с помощью газовой хроматографии. Первичная биодеградация нефти в пробирках оценивалась по следующим параметрам: разбиванию поверхностной пленки нефти, помутнению питательной среды за счет роста биомассы, образованию однородной эмульсии нефти в среде, газообразованию.

Выбор эффективных штаммов-деструкторов осуществляли по результатам хроматографических исследований и способности к росту и утилизации нефти при температуре 4-8º С.  

Чистые культуры микроорганизмов-деструкторов исследовали на наличие ферментативных свойств: протеолитической, амилолитической, желатиназной, каталазной, цитратной, оксидазной активности, способности к сбраживанию углеводов. Идентификацию штаммов бактерий осуществляли по определителю Берджи [6].

Косвенные признаки патогенности выявляли после постановки теста на наличие гемолизиса на кровяном агаре, фибринолитических и плазмокоагулирующих свойств с цитратной кроличьей плазмой. 

Эксперименты с деструкцией нефти в почве  производились в пластиковых контейнерах при температурах 8 ºС и 4 ºС в течение 28 сут. Содержание нефти в почве составляло 10 % по весу. При этом на 1 г почвы вносилось 106 КОЕ чистой культуры. 

Количественное определение содержания предельных углеводородов в образцах проводили методом капиллярной газовой хроматографии на приборе Varian 3600, оснащенном колонкой J&W Scientific DB-5, 30 м. х 0.22 мм, инжектором с делением потока (темп. 320 ºС), пламенно-ионизационным детектором (темп. 335 ºС), системой регистрации и обработки хроматографических данных (ChromStar, Bruker). В ходе анализа программировали изменение температуры колонки: 50 ºС - 2 мин , 50 ºС - 320 ºС - 15 ºС /мин , 320 ºС - 5 мин. Отнесение хроматографических пиков выполняли по времени удерживания с использованием калибровочного образца Boiling Point Calibration Sample #1, «ULTRA Scientific, Inc.», США.

Результаты исследования и их обсуждение

Из природных загрязненных нефтью субстратов были выделены 13 чистых культур микроорганизмов, обладающих способностью к активному росту на селективных питательных средах с нефтью.

На основе анализа литературных данных можно сделать вывод, что наиболее распространенными в загрязненных нефтью местообитаниях являются бактерии, а именно представители родов Rhodococcus, Arthrobacter, Acinetobacter. Micrococcus, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus [5, 7, 8, 9, 10]. В хронически загрязненных экосистемах безусловным доминантом являются родококки. Углеводородокисляющие дрожжи и мицелиальные грибы в загрязненных водных экосистемах занимают второстепенное место.

Таксономическая принадлежность природных изолятов, наиболее эффективно утилизировавших нефть по результатам визуального контроля, определена к родам Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Bacillus sp., Enterobacter sp., что согласуется с литературными данными. У этих штаммов были исследованы морфологические, биохимические и физиологические свойства (табл. 1). Косвенные признаки патогенности не выявлены.

Таблица 1. Биохимические свойства штаммов-деструкторов нефтепродуктов

№ штамма/

свойства

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

 

Acinetobacter sp. №1

Pseudomonas sp. ТЕТР-1-кр

Pseudomonas sp. Гос №2

Pseudomonas sp. №8

Acinetobacter  sp. Ставр 6

Enterobacter  sp. ГАВ 2-гл

Rhodococcus  sp. ГАВ 2-мат

Bacillus sp. №3

Bacillus sp. №5

Pseudomonas sp. ТЕТР -1-мел

Acinetobacter sp. №4

Bacillus sp. №2в

Acinetobacter sp. №7

Окрашивание по Граму

Гр-

Гр-

Гр-

Гр-

Гр-

Гр-

Гр+

Гр+

Гр+

Гр-

Гр-

Гр+

Гр-

Разжижение желатина

-

+

+

+

-

+

-

-

-

+

-

-

-

Протеолиз (казеинолитическая активность)

-

-

+

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

Каталазная активность

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Амилолитическая активность

-

-

-

+/-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Оксидазная активность

-

+

+

+

+

-

-

+

+

+

-

+/-

-

Реакция с метиловым красным

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Цитратная активность

-

+

+

+

-

+

+

+

+

+

-

+

-

Плазмокоагулазная активность

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Фибринолитическая активность

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Гемолитическая активность

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Выделенные тринадцать наиболее эффективных штаммов-деструкторов были внесены в емкости с загрязненной высокопарафинистой нефтью почвой с целью выяснения степени ее деструкции, а также разложения н-алканов. В результате было показано, что все штаммы деградируют за 4 недели до 69,4-89,9 % нефти. Количество предельных углеводородов твердой фракции (С17-С39) при этом снижалось на 60,7-84,9 % (табл. 2). Лучшие результаты по деструкции твердых алканов были показаны у штаммов 2, 4, 6, 12, 13, которые были объединены в микробную ассоциацию ДТА-1.

Таблица 2. Остаточное количество предельных углеводородов в образцах почвы после культивирования со штаммами микроорганизмов

Наименование образца

Остаточное количество нефтепродуктов

Остаточное количество предельных углеводородов С17-С39

Сумма, мг/10 г

Сумма, %

Сумма, мг/10 г

Сумма, %

контроль

880,45

100

442,74

100

1

269,76

30,64

174,13

39,33

2

120,37

10,25

71,74

16,20

3

224,54

25,50

163,13

36,85

4

102,6

11,65

84,63

19,11

5

205,67

23,36

138,79

31,35

6

91,41

10,38

74,89

16,92

7

148,22

16,83

125,22

28,28

8

170,19

19,33

122,78

27,73

9

185,23

21,04

167,43

37,82

10

131,7

14,96

123,9

27,98

11

226,77

25,76

216,44

48,89

12

108,7

10,12

66,69

15,06

13

112,75

12,81

101,72

22,98

Ассоциация

ДТА-1

-

-

45,18

10,20

Полученная ассоциация из 5 штаммов ДТА-1 была изучена на способность к деструкции нефтяной фракции твердых алканов при низких положительных температурах. Степень деструкции твердых алканов С17-С39 ассоциацией ДТА-1 составила 89,8 %.

Для определения влияния температуры на скорость и степень деструкции твердых алканов штаммами микроорганизмов-деструкторов нефти проведены сравнительные эксперименты при разных температурах (+4 ºС и +8 ºС). В целом, нужно отметить, что температура культивирования влияет только на скорость деструкции. При температуре +4 ºС степень деструкции твердых алканов на 5-11 % ниже по сравнению со степенью деструкции при температуре +8 ºС.

Заключение

Проведенные эксперименты показали наличие высокоэффективной нефтеразлагающей аборигенной микробиоты в местах разливов нефти в ЯНАО. Выделенные микроорганизмы способны к деструкции многих компонентов нефти, в т.ч. твердых алканов. Наиболее эффективные биодеструкторы были объединены в ассоциацию бактериальных штаммов ДТА-1, которая может быть рекомендована для разработки препарата, направленного для очистки загрязненных нефтью территорий в условиях севера, а также обработки цистерн и др. емкостей, длительное время используемых для хранения нефтепродуктов.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (ГК № 16.512.11.2160).

Рецензенты:

  • Беднаржевский С.С., д.т.н., профессор, заведующий кафедрой «Безопасность жизнедеятельности» Сургутского государственного университета,. г. Сургут.
  • Загребельный С.Н., д.б.н., профессор кафедры химии окружающей среды Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», г. Новосибирск.

Библиографическая ссылка

Алексеев А.Ю., Смородина Е.А., Адаменко Л.С., Емельянова Е.К., Забелин В.А., Ильичева Т.Н., Резников В.А., Шестопалов А.М., Алексеев А.Ю., Емельянова Е.К., Ильичева Т.Н., Шестопалов А.М. ПОДБОР АССОЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ–ДЕСТРУКТОРОВ НЕФТЯНОЙ ФРАКЦИИ ТВЕРДЫХ АЛКАНОВ ПРИ НИЗКИХ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ // Современные проблемы науки и образования. – 2011. – № 6. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=4939 (дата обращения: 24.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074