Проникновение моноцитов в ткани контролируется эндотелием. При активации моноцитов изменяется их фенотип, увеличивается выработка молекул адгезии и взаимодействие с эндотелием. В культуре моноциты способны приобретать фенотип эндотелиальных клеток и экспрессировать эндотелин-специфические маркеры (СD31 и др.). Действуя аналогично провоспалительным цитокинам, МСР-1 также стимулируют неоваскуляризацию подобно васкулоэндотелиальному фактору роста [9]. Эндотелиальная дисфункция (ЭД) вносит вклад в патогенез различной патологии, в том числе заболеваний печени, в частности, повышенная выработка эндотелина-1 (Ет-1) ухудшает кровообращение в печени и также активирует звездчатые клетки печени, что способствует развитию фиброза в органе. Активированные звездчатые клетки в свою очередь вырабатывают Ет-1, что способствует образованию порочного патогенетического круга при заболеваниях печени [10].
Общеизвестен факт снижения фагоцитарной активности лейкоцитов (ФАЛ) при ХГ и ЦП, что может быть обусловлено влиянием вирусной инфекции и эндогенной интоксикации. Снижение ФАЛ и показателя абсолютного фагоцитоза может быть связано с тем, что индукция синтеза MCP-1 оказывает регулирующее влияние на синтез ФНО-a, что коррелирует со снижением фагоцитарной активности клеток крови, так как и MCP-1 и ФНО-a вызывают изменение активности ферментов клетки, участвующих в осуществлении фагоцитарных реакций. Кроме того, ФНО-a вызывает перераспределение пулов клеток крови, что находит отражение в снижении пула циркулирующих лейкоцитов [2].
Важной задачей гепатологии в настоящее время является изучение новых диагностических маркеров фиброза печени, что имеет значение для прогноза и мониторинга терапии пациентов с ХГ. Среди прямых лабораторных маркеров фиброза печени большой информативностью обладает гиалуроновая кислота (ГК), которая позволяет стратифицировать минимальный фиброз при ХГ и выраженный фиброз при переходе заболевания в стадию ЦП с чувствительностью 80% и специфичностью 80% [7].
Взаимосвязи МСР-1, фагоцитоза с эндотелиальной дисфункцией и тестами фиброза при патологии печени изучены недостаточно.
Цель исследования: изучить взаимосвязи МСР-1, показателей фагоцитоза с маркерами функционального состояния эндотелия и фиброза печени у больных с ХГ и ЦП и оценить диагностические возможности исследуемых лабораторных тестов.
Материалы и методы. Исследование проведено в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации. Обследовано 40 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С в фазе реактивации, мужчин - 25, женщин - 15. Вторую группу составили 15 пациентов ЦП вирусной этиологии в стадии декомпенсации, из них 8 мужчин, 7 женщин. Критерии исключения - состояния, сопровождающиеся ЭД: сердечно-сосудистые заболевания (атеросклероз, ИБС, артериальная гипертензия, аритмии, инсульты в анамнезе), сахарный диабет, бронхиальная астма, онкологические заболевания, беременность. Средний возраст больных ХГ составил 38,8±14,5 лет, при ЦП - 49,8±12,2 года. Контрольная группа состояла из 13 практически здоровых лиц, не имеющих в анамнезе заболеваний печени, возраст - 32,8±8,3 года. В предыдущих исследованиях нами было показано отсутствие взаимосвязи между ЭД, возрастом и полом при ХГ и ЦП.
Помимо общеклинического и инструментального обследования (УЗИ, сцинтиграфия), определения серологических маркеров вирусных гепатитов (HBsAg и анти-HCV Jg G и М, ПЦР - индикация HCV - РНК), определяли концентрацию МСР-1 в сыворотке («Вектор-Бест», г. Новосибирск), подсчитывали показатели фагоцитоза: ФАЛ, фагоцитарный индекс (ФИ), абсолютный фагоцитоз (АФ) с использованием формализированных эритроцитов барана. Изучались тесты оценки функционального состояния эндотелия в сыворотке крови методом ИФА на аппарате StatFax (США): уровень общего оксида азота (ОА) (SYSTEMS, США), Ет-1 (BIOMEDICA CRUPPE, США), васкулоэндотелиального фактора роста (ВЭФР) («Вектор-Бест», Россия), определение функциональной активности фактора Виллебранда (ФВ) (Technoklon vWF:CBA ELISA, США). Проводили подсчет количества десквамированных эндотелиоцитов (ДЭЦ) в плазме крови по методу Hladovec, 1978 г. [1]. Определяли ГК в сыворотке крови с помощью набора ВСМ Diagnostics (США) методом ИФА. Для оценки диагностической чувствительности и диагностической специфичности лабораторных показателей и возможности стратификации ХГ и ЦП были построены кумулятивные кривые, найдены точки разделения показателей у обследованных групп пациентов, определена диагностическая эффективность тестов (Власов В.В., 2001).
Результаты обработаны при помощи пакета программ Statistica 6.0 Microsoft и Office Excell 2003. Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стъюдента. Для описания полученных количественных признаков, имеющих нормальное распределение, использовалось среднее арифметическое М ± одно среднее квадратичное стандартное отклонение (σ). Для корреляционного анализа применялся расчет средних величин показателей корреляционных отношений для количественных признаков по Пирсону (r). Связь между показателями оценивалась как сильная при r > 0,7, средней силы - при r от 0,3 до 0,7, слабая - при r < 0,3. Различия между выборками считались статистически достоверными при значении для р < 0,05.
Результаты исследования и обсуждение. У больных ХГ выявлено достоверное повышение содержания в крови МСР-1 по сравнению с группой практически здоровых лиц: 154,5±77,5 пг/мл и 336,7±199,8 пг/мл соответственно, что свидетельствует о стимуляции макрофагального воспалительного ответа при хронической вирусной инфекции в фазе реактивации (табл. 1). При ЦП концентрация МСР-1 не отличалась от значений контрольной группы, что свидетельствует об уменьшении воспалительного процесса на фоне прогрессирования фиброза в печени. Нам представляется, что выработка МСР-1 повышается в начале развития фиброза, когда воспалительные и некротические процессы наиболее выражены, при стихании их, по мере замещения ткани печени соединительной тканью, менее чувствительной к недостатку кислорода и уровню эндогенной интоксикации, МСР-1 снижается. Тем не менее у ряда пациентов этой группы концентрация цитокина была выше показателей в группе сравнения, что служит свидетельством сохраняющейся активности воспаления при ЦП. Выявлены достоверные различия между повышенной концентрацией МСР-1 при ХГ и «нормализацией» этого показателя при ЦП. Интересно, что ФАЛ в обеих группах больных была одинаково достоверно снижена по сравнению с нормой: 37,8±15,3 при ХГ и 37,8±16,5 % у больных ЦП. На фоне снижения количества фагоцитов среднее значение ФИ как при ХГ, так и при ЦП было в пределах нормы. АФ при ХГ и ЦП был достоверно ниже по сравнению с контрольной группой: 79,8±33,5 и 82,8±33,9 на 100 фагоцитов соответственно (р=0,003 и р=0,01). Снижение ФАЛ и АФ на фоне активности воспалительного процесса может быть связано с изменением иммунной реактивности на фоне активной репликации вируса, что сопровождается увеличением выработки МСР-1. При развитии выраженного фиброза на стадии формирования цирроза печени показатели фагоцитоза снижены в такой же степени, что может быть связано с преобладанием метаболических нарушений, в том числе со снижением антитоксической функции печени, что угнетает фагоцитоз на фоне ЦП. Нами было выявлено достоверное снижение лейкоцитов в обеих группах больных по сравнению с контролем. Это может быть связано с опосредованными влияниями через МСР-1 и ФНО-a как на снижение лейкоцитоза, так и на торможение фагоцитоза при ХГ, возможны и аутоиммунные нарушения за счет инфекции вирусом гепатита С. При ЦП к снижению лейкоцитов ведет гиперспленизм. Между группами больных различий в уровне лейкоцитов не выявлено.
Таблица 1 - МСР-1, показатели фагоцитоза, маркеры фиброза и эндотелиальной дисфункции у больных хроническим гепатитом, циррозом печени и в группе контроля
Показатели |
Здоровые (n=13) |
ХГС (n=40) |
ЦП (n=15) |
р |
||
р1 |
р2 |
р3 |
||||
МСР-1, пг/мл |
154,5±77,5 |
336,7±199,8 |
147,9±89,8 |
0,03* |
0,8 |
0,006* |
ФАЛ, % |
57,9±16,3 |
37,8±15,3 |
37,8±16,5 |
0,004* |
0,01 |
0,9 |
ФИ |
2,15±0,17 |
2,17±0,5 |
2,25±0,49 |
0,9 |
0,5 |
0,6 |
АФ |
125,9±39,6 |
79,8±33,5 |
82,8±33,9 |
0,003* |
0,01 |
0,8 |
Лейкоциты, 10^9/л |
7,29±2,11 |
5,27±1,92 |
4,84±2,2 |
0,016* |
0,018* |
0,5 |
OА, мкмоль/л |
29,43± 3,34 |
18,7 ± 3,02 |
13,07± 4,52 |
0,001* |
0,001* |
0,01* |
Eт-1, фмоль/л |
0,46±0,09 |
0,62±0,20 |
1,1±0,5 |
0,1 |
0,007* |
0,005* |
ДЭЦ, 104 /л |
3,18 ± 1,32 |
7,3 ± 4,0 |
10,0 ±4,0 |
<0,001* |
<0,001* |
<0,04* |
ВЭФР, пг/мл |
158,7±72,8 |
249,5±94,5 |
375,0±116,6 |
0,01* |
0,001* |
0,001* |
ФВ, % |
55,5±37,9 |
143,8±66,7 |
194,5±28,2 |
0,007* |
<0,001* |
0,02* |
ГК, нг/мл |
17,8±17,0 |
70,38±52,8 |
506,5±388,2 |
0,02* |
0,007* |
<0,001* |
АСТ/АЛТ |
0,8±0,12 |
0,83±0,4 |
2,37±1,80 |
0,1 |
0,02* |
<0,001* |
р1 - достоверность отличий в группах здоровых и больных ХГ;
р2 - достоверность отличий в группах здоровых и больных ЦП;
р3 - достоверность отличий в группах больных ХГ и ЦП;
* - различия достоверны.
У обследованных пациентов с ХГ и ЦП закономерно выявляются лабораторные признаки поражения эндотелия в виде снижения концентрации в крови ОА, увеличения Eт-1, ДЭЦ, ВЭФР и ФВ, что свидетельствует о нарушении кровообращения в печени, повреждении эндотелия, неоангиогенезе, активации адгезии и агрегации тромбоцитов (табл. 1).
Показатели фиброза демонстрировали следующие изменения (табл. 1): концентрация ГК была достоверно выше при ХГ и особенно при ЦП по сравнению с группой контроля (70,38±52,8 нмоль/л и 506,5±388,2 нмоль/л соответственно), между группами больных также были достоверные различия. Коэффициент де Ритиса (соотношение АСТ/АЛТ) при ХГ практически не отличался от контрольной группы, а при ЦП был существенно выше, чем у здоровых (р2=0,02) и у пациентов с ХГ (р3=0,0003), и составил 2,37±1,8. Известно, что повышение коэффициента де Ритиса связано с увеличением выхода митохондриальной АСТ и нарушением синтеза АЛТ, возрастание коэффициента указывает на прогрессирование цирроза и прогнозирует плохой исход заболевания.
При определении операционных характеристик исследуемых тестов получены следующие данные. Диагностическая чувствительность показателя МСР-1 при точке разделения 175 пг/мл для ХГ составила 59%, диагностическая специфичность теста для исключения ЦП - 60% (табл. 2). Хотя различие концентрации МСР-1 при ХГ и ЦП было достоверно, интегративный показатель эффективности теста МСР-1 составил 59%, то есть информативность показателя для стратификации гепатита и цирроза относительно невысока. Операционные характеристики показателей фагоцитоза подсчитаны в целом при хронических диффузных заболеваниях печени, так как значения в группах ХГ и ЦП не отличались. Диагностическая эффективность ФАЛ при точке разделения 45% для больных хроническими диффузными заболеваниями печени составила 78%. Более информативный тест - АФ: диагностическая эффективность его достигла 86%.
Таблица 2 - Операционные характеристики тестов определения МСР-1, показателей эндотелиальной дисфункции и фиброза печени при хроническом гепатите и циррозе печени
Тесты |
Точка разделения |
Диагностическая чувствительность, % |
Диагностическая специфичность, % |
Диагностическая эффективность, % |
МСР-1, нг/мл |
175 |
59 |
60 |
59 |
OА, мкмоль/л |
17,0 |
80 |
87 |
86 |
Eт-1, фмоль/л |
0,8 |
73 |
88 |
83 |
ДЭЦ, 104/л |
7,1 |
80 |
85 |
85 |
ВЭФР, пг/мл |
260,0 |
83 |
69 |
79 |
ФВ, % |
105,0 |
92 |
50 |
69 |
ГК, нг/мл |
120,0 |
92 |
76 |
82 |
АСТ/АЛТ |
1,5 |
67 |
96 |
87 |
При исследовании маркеров фиброза для стратификации ХГ и ЦП эффективность теста определения ГК составила 82%, АСТ/АЛТ - 87%. Полученные результаты свидетельствуют о несколько большей эффективности коэффициента де Ритиса для диагностики ЦП, возможно, это связано с наличием выраженного фиброза и перехода в цирроз у пациентов с диагнозом ХГ, поставленным на основании традиционного клинического и инструментального обследования, у которых были повышены ГК и АСТ/АЛТ. Эффективность показателей состояния эндотелия для дифференциации гепатита и цирроза составила от 69 до 86%, при этом наиболее эффективным тестом для этих целей оказался ОА.
Выявлены взаимосвязи умеренной силы и сильные между показателями неспецифической иммунной реактивности, эндотелиальной дисфункции и маркерами фиброза при ХГ и ЦП (табл. 3).
Таблица 3 - Корреляции МСР-1, параметров фагоцитоза, эндотелиальной дисфункции и фиброза при хроническом гепатите и циррозе печени
Показатели |
ХГ |
ЦП |
||
r1 |
р1 |
r2 |
р2 |
|
МСР-1 и ФАЛ |
0,5 |
0,04* |
0,4 |
0,3 |
МСР-1 и И |
0,7 |
0,002* |
0,1 |
0,6 |
МСР-1 и АФ |
0,7 |
0,01* |
0,1 |
0,5 |
МСР-1 и OА |
-0,8 |
0,0001* |
-0,9 |
0,0003* |
МСР-1 и Eт-1 |
0,9 |
0,0004* |
0,9 |
0,004* |
МСР-1 и ГК |
-0,23 |
0,3 |
-0,7 |
0,03* |
МСР-1 и АСТ/АЛТ |
-0,6 |
0,004* |
-0,17 |
0,5 |
ФАЛ и OА |
0,96 |
0,003* |
0,9 |
0,03* |
ФАЛ и лейкоциты |
0,23 |
0,32 |
0,59 |
0,04* |
ФИ и ОА |
0,9 |
0,001* |
0,2 |
0,7 |
ФИ и ДЭЦ |
-0,5 |
0,04* |
-0,04 |
0,8 |
АФ и ОА |
0,08 |
0,77 |
0,61 |
0,044* |
r1 - взаимосвязь показателей в группе больных ХГ;
r2 - взаимосвязь показателей в группе больных ЦП;
p1 - достоверность корреляции в группе пациентов с ХГ;
p2 - достоверность корреляции в группе пациентов с ЦП;
* - различия достоверны.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при ХГ показатели фагоцитоза и МСР-1 достоверно взаимосвязаны, то есть чем больше выраженность воспаления в печени, тем активнее фагоцитоз. Поражение эндотелия также нарастает при увеличении выработки МСР-1, что проявляется в сильной прямой взаимосвязи этого показателя с Ет-1 и обратной - с ОА. Интересно, что ряд показателей фагоцитоза положительно связаны с ОА и отрицательно с ДЭЦ, что свидетельствует о нарастании депрессии фагоцитоза при усугублении дисфункции эндотелия на фоне хронических диффузных заболеваний печени. Такой показатель фиброза, как АСТ/АЛТ, демонстрирует умеренные отрицательные взаимосвязи с МСР-1 при ХГ, то есть чем выше активность воспаления, тем ниже коэффициент де Ритиса на фоне обычно сопутствующего воспалению в печени цитолиза, а при стихании воспаления и активации/td фиброза соотношение АСТ/АЛТ повышается. У пациентов с ЦП взаимосвязь МСР-1 как показателя воспаления с показателями фагоцитоза теряется, но сохраняется корреляция с тестами, характеризующими эндотелиальную дисфункцию: обратная с ОА и прямая с Ет-1. У пациентов с циррозом также появляется корреляция умеренной силы МСР-1 с прямым маркером фиброза - ГК, что свидетельствует о прогрессировании фиброза и при снижении концентрации МСР-1 в данной группе больных.
Заключение. Повышение концентрации МСР-1 в крови при ХГ отражает активность воспаления в печени, при ЦП содержание этого цитокина снижается. Тем не менее диагностическая эффективность теста МСР-1 для стратификации ХГ и ЦП относительно невысока. Параметры фагоцитоза в равной степени снижены при ХГ и ЦП, при этом МСР-1 демонстрирует прямую взаимосвязь с показателями фагоцитоза у больных ХГ. Выработка МСР-1 коррелирует с выраженностью эндотелиальной дисфункции при ХГ, что имеет место и у больных ЦП, несмотря на снижение этого показателя. МСР-1 также участвует в активации фиброза печени на стадии активного воспаления при ХГ, что подтверждается взаимосвязью с непрямым маркером фиброза печени - соотношением АСТ/АЛТ. МСP-1 может служить показателем активности процессов фиброза в печени при формировании цирроза после хронического вирусного гепатит, так как при ЦП выявлена взаимосвязь с прямым маркером фиброза - ГК.
Таким образом, выявлена патогенетическая взаимосвязь между воспалением в печени, депрессией фагоцитоза, выраженностью эндотелиальной дисфункции и активацией фиброза при хроническом вирусном гепатите С и участие этих механизмов в развитии ЦП. Маркеры неспецифической иммунной реактивности и эндотелиальной дисфункции могут использоваться для диагностики и дифференциальной диагностики гепатита и цирроза печени с достаточно высокой эффективностью.
Рецензенты:
- Гейн С.В., д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УРО РАН, г. Пермь.
- Устинова О.Ю., д.м.н., профессор кафедры экологии человека и безопасности жизнедеятельности Пермского государственного национального исследовательского университета, г. Пермь.
Работа получена 24.10.2011