Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Цель работы: исследовать содержание ПЩФ в некоторых тканях и сыворотке крови человека в онтогенезе и при патологии для определения её диагностического значения.

Объект исследования. Водно-солевые и бутаноловые экстракты, гистологические срезы плодовой, дефинитивной и патологически изменённой легочной ткани (159 образцов), плаценты (6), костей, печени, почек, желудка, кишечника головного мозга от 26 плодов 9-36 недель внутриутробного развития, 60 образцов бронхиального секрета (мокроты), 329 сывороток крови беременных, 26 - родильниц, 350 сывороток крови больных злокачественными новообразованиями, 390 - больных с хроническими воспалительными заболеваниями внутренних органов, 290 - здоровых доноров (160 женщин и 130 мужчин).

Методы исследования. В экстрактах и гистологических срезах ПЩФ определяли с помощью моноспецифической тест-системы, полученной в нашей лаборатории. Тест-антиген представлен раствором ПЩФ, выделенной из плаценты методом водно-солевой и бутаноловой экстракции на трис-глициновом буфере (рН 8,6) и очищенной по методу Lehman [10]. Тест-антисывороткой служила моноспецифическая антисыворотка к ПЩФ, полученная иммунизацией кроликов с последующей дополнительной абсорбцией дефинитивными тканями по общепринятой методике [5]. В экстрактах тканей и сыворотках крови ПЩФ выявляли методом встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ). Иммуноэлектрофореграммы отмывали в забуференном физиологическом растворе хлорида натрия и обрабатывали смесью нафтол-AS-фосфат и прочный синий РР по Берстону [3]. Линии преципитации, образованные антисывороткой и ПЩФ, окрашиваются в интенсивный синий цвет. Чувствительность ВИЭФ для ПЩФ равна 1 ЕД Боданского [5]. В реакции иммунофлуоресценции на криостатных срезах тканей использовали эту же антисыворотку и ослиные антитела против иммуноглобулина кролика, меченные флуоресцином, производства НИИ вакцин и сывороток им. Н.Ф. Гамалея [1]. Статистическую обработку проводили с использованием критерия Стьюдента [5].

Результаты и обсуждение

Плацента. В связи с тем, что становление синтеза ПЩФ в плаценте хорошо описано в литературе, мы специально этот вопрос не исследовали. По данным авторов [5; 6; 7; 8], активность ЩФ отмечается в синцитиотрофобласте с 16 недель внутриутробного периода развития. Мы выявили, что ПЩФ методом встречного иммуноэлектрофореза определяется как в водно-солевых, так и бутаноловых экстрактах зрелой плаценты, причём наибольшее количество фермента экстрагируется бутанолом из её мембранных фрагментов, оставшихся после водно-солевой экстракции, соответственно, титры 1:512 и 1:2048. Гистохимическим методом высокая активность ПЩФ отмечается в эндотелии сосудов, синцитиотрофобласте плаценты.

Сыворотка крови беременных. Частота обнаружения ПЩФ возрастает по мере развития беременности с 6,4% в первом триместре до 100% к концу срока беременности. Примечателен факт обнаружения ПЩФ в сыворотке крови в 2-х из 3-х образцов первого месяца беременности (3 и 4 недели). Появление ПЩФ в кровотоке матери в столь ранние сроки нельзя объяснить продукцией ПЩФ плацентарной тканью, так как она ещё практически отсутствует. В данном случае вопрос об источнике сывороточной ПЩФ остаётся открытым. С 4-го месяца беременности, после завершения периода формирования плаценты, частота обнаружения и титр ПЩФ в кровотоке матери начинают возрастать с 13,3 до 68,7% и 1-1/8 титра (1-8 ЕД Боданского, соответственно) к 8-му месяцу. Значительное увеличение частоты обнаружения ПЩФ в сыворотке крови наблюдается с 5-го месяца беременности. Это совпадает с периодом интенсивного развития головного мозга плода, роста и дифференцировки всех его органов [14].

К моменту родов (10 месяцев) у всех женщин (100%) в сыворотке крови ПЩФ присутствует в количестве 8-32 ЕД (до 64 ЕД в отдельных случаях), что определено нами как количество ПЩФ, необходимое для нормального протекания беременности [2; 14]. При поздних гестозах 2-3 степени титр ПЩФ в кровотоке снижается до 0-4 ЕД, что может указывать на плацентарную недостаточность [2].

Обращает на себя внимание впервые выявленный нами факт наличия ПЩФ в крови родильниц, где она определяется в титре 1/8-1/32 (8-32 ЕД) до момента выписки из стационара (8-14 дней). При этом мы обратили также внимание на суточные колебания (повышение - понижение - повышение - понижение) титра ПЩФ у родильниц в динамике послеродового периода. У этих пациенток отсутствует плацента, тогда как наличие ПЩФ, причём с суточными колебаниями её концентрации в крови в течение 1-2 недель, позволяет предположить наличие другого, кроме плаценты, источника ПЩФ. Не исключено, что им является сокращающаяся матка. Так, в большинстве случаев у родильниц мы наблюдали даже повышение уровня ПЩФ в крови после родов, по сравнению с дородовым периодом, что не согласуется с данными о периоде её полураспада [2]. При изучении сывороток крови 26 женщин в более отдаленные сроки постнатального периода (через месяц после родов и более) методом ВИЭФ мы не выявили в них ПЩФ.

Легочная ткань. ПЩФ начинает выявляться в водно-солевых экстрактах в фетальной лёгочной ткани с 26 недель внутриутробного развития плода в 72,7% случаев в количестве 4,2±1,8 ЕД. К моменту рождения частота обнаружения этого энзима снижается до 30% (1,4±0,4 ЕД), а в дефинитивной ткани лёгких ПЩФ не определяется (табл. 1). Определение ПЩФ в бутаноловых экстрактах фетальных органов позволило выявить небольшие количества этого антигена (1-2 ЕД) в печени, в почках, ЖКТ, лёгких. Отсутствие ПЩФ в сыворотках крови плодов и водно-солевых экстрактах других фетальных органов, кроме лёгких, исключают возможность попадания её из плаценты и делает допустимым предположение о синтезе её в плодовой лёгочной ткани и других органах [2; 5]. Иммуноморфологические исследования с антисывороткой к ПЩФ методом непрямой иммунофлюоресценции Кунса подтвердили наличие ПЩФ в клетках эмбрионального эпителия фетального лёгкого. Интенсивное свечение отмечается преимущественно в области наружных мембран клеток [5].

Костная ткань. Нами обнаружена высокая активность ЩФ гистохимическим методом в зоне активного новообразования костной ткани (зона роста, периостальный слой и эндотелий новообразующихся сосудов и гаверсовых каналов). Использование непрямого метода Кунса с моноспецифической антисывороткой к ПЩФ показало наличие ПЩФ плацентарного типа в указанных тканевых структурах [6].

Таким образом, с помощью различных методик (энзимоиммуноэлектрофорез, иммуноморфологический и иммуногистохимический методы) мы выявили наличие ЩФ плацентарного типа не только в ткани плаценты, но и в других эмбриональных тканях [6; 15].

ПЩФ не обнаруживается в лёгочной ткани при хронических неспецифических заболеваниях легких (ХНЗЛ) и у здоровых людей. В водно-солевых экстрактах малигнизированной легочной ткани ПЩФ выявляется в 61,5-70% образцов (табл. 1).

Таблица 1 - Обнаружение ПЩФ в водно-солевых экстрактах легочной ткани методом ВИЭФ

*, ** p ˂ 0,001.

Изучение гистологических срезов раковых опухолей также показало довольно высокую частоту (до 72,7%) обнаружения ПЩФ в эпителиальных клетках и строме рака лёгкого, причём наибольшая активность отмечена в аденокарциномах и низкодифференцированных формах рака. Эта же закономерность подтверждена и при иммуноэнзимохимическом анализе экстрактов рака лёгкого (табл. 1). Выявлено достоверно более высокое (в 8 раз) содержание ПЩФ в низкодифференцированном раке лёгкого, по сравнению с высокодифференцированным (р<0,001). ПЩФ обнаруживается также и в околоопухолевой лёгочной ткани, взятой на расстоянии 5-15 см от края опухоли в количестве 12,6±2,4 ЕД. Иммуногистохимически специфическое свечение отмечается в эндотелии новообразующихся сосудов и фибробластах. Этот факт паранеопластической продукции ПЩФ, так же как и другие антигенные отличия околоопухолевой легочной ткани и опухоли при раке легкого, обнаружены впервые А.Е. Сухаревым [5].

Бронхиальный секрет. Методом встречного иммуноэлектрофореза ПЩФ в жидкой части мокроты больных ХНЗЛ и раком лёгких не определяется. Методом непрямой иммунофлуоресценции с антисывороткой к ПЩФ выявляется специфическое свечение на +++ (+) клеточных элементов цитологических препаратов из мокроты и аспирационного материала бронхов, полученного при фибробронхоскопии, при раке лёгких в 89%, а при ХНЗЛ - лишь на + (+) - в 25% (табл. 2). При этом среди клеток, содержащих ПЩФ, нам не удалось обнаружить злокачественных. В большинстве случаев они были представлены клетками пролиферирующего бронхиального эпителия с примесью альвеолярных макрофагов и нейтрофилов.

Таблица 2 - Определение ПЩФ в бронхиальном секрете

*, ** p ˂ 0,001.

По нашему мнению, наличие ПЩФ в незлокачественных клетках бронхиального секрета является результатом её паранеопластической продукции в околоопухолевой ткани и может быть косвенным признаком рака лёгкого при перибронхиальной форме его роста [5].

Плевральные выпоты. ПЩФ методом встречного иммуноэлектрофореза обнаруживается в 31,6% в плевральных экссудатах только у больных раком лёгкого (табл. 3).

Таблица 3 - Определение ПЩФ в плевральных выпотах при лёгочной патологии

*, ** p ˂ 0,001.

Сыворотка крови. По нашим и литературным данным, частота положительных тестов на ПЩФ в сыворотке крови у больных с незлокачественной патологией различных органов (ХНЗЛ, туберкулёз легких, мастопатия, гастродуодениты, панкреатиты, колиты, пиелонефриты) регистрируется в 2,2% в количестве 1-2 ЕД, а при злокачественных новообразованиях - от 14,1% (рак легких) до 59% (рак яичников) в количестве 2-8 ЕД [2; 5; 8; 9; 11; 12; 13; 16]. При первичном и метастатическом раке печени ПЩФ выявляется методом ВИЭФ в сыворотке крови в 37,5% случаев [2; 5; 7].

Учитывая, что ПЩФ при раке лёгкого обнаруживается в наиболее злокачественных низкодифференцированных опухолях, то появление её в плевральных выпотах, вероятно, обусловлено продукцией опухолевой и околоопухолевой тканей при метастатическом поражении плевры. Установлено, что изоэнзимы ПЩФ обнаруживаются также и в злокачественных опухолях гортани, пищевода, желудка, толстой кишки, печени, простаты, яичек и яичников [2; 5; 6; 7; 8; 9; 12; 13; 16].

Таким образом, в пренатальном онтогенезе изоэнзимы ПЩФ синтезируются в определённых клетках трофобласта, желточного мешка и зародышевых клетках, которые, при возникновении из них опухолевых линий (герминогенные опухоли), возобновляют продукцию ПЩФ в значительных количествах [4]. Согласно гипотезе, объясняющей синтез неопластической клеткой белков, не свойственных данному типу клеток в норме, этот процесс является следствием депрессии генома, сопровождающего неопластическую трансформацию [8; 9; 12]. Следовательно, идентификация ПЩФ в тканях и биологических жидкостях может быть использована в уточняющей диагностике, контроле лечения и мониторинге злокачественных новообразований. Поскольку ПЩФ считается маркёром герминогенных опухолей [4], то обнаружение её при раке легкого и других локализациях, на наш взгляд, следует учитывать при разработке схем химио-, гормонотерапии.

(Научные проекты № 10-06-00621а, № 09-06-00933а, поддержанные грантами РГНФ.)

Рецензенты:

• Лазько А.Е., д.м.н., профессор, зав. кафедрой патанатомии Астраханской государственной медицинской академии, г. Астрахань.
• Бойко О.В., д.м.н., профессор кафедры Молекулярной биологии и биохимии ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет», г. Астрахань.

Работа получена 24.10.2011