В настоящее время известно более 150 генов, принимающих участие в различных путях репарации [9]. Считается, что большинство повреждений ДНК удаляется белками эксцизионной репарации оснований (base excision repair, BER). Среди генов, кодирующих ферменты BER, особое внимание привлекают hOGG1, ADPRT и XRCC1.
Ген XRCC1 (x-ray cross-complementing group 1) кодирует регуляторный белок репарации, который не имеет ферментативной активности, но осуществляет координационную функцию. XRCC1 взаимодействует с поли-АДФ-полимеразой, ДНК-лигазой 3, ДНК-полимеразой β, APE1. [8]. К числу наиболее изученных полиморфизмов гена XRCC1 относятся: XRCC1 Arg194Trp, XRCC1 Arg280His, XRCC1 Arg399Gln.
Ген hOGG1 (human 8-oxoguanine DNA glycosylase) кодирует ключевой фермент BER, удаляющий из ДНК остатки 8-оксогуанина, образующегося под действием активных форм кислорода. Один из полиморфизмов гена hOGG1, приводящий к замене Ser на Cys в 326 положении, ассоциирован со сниженной активностью фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы [2]. Ген ADPRT (adenosine diphosphate ribosyl transferase) кодирует ассоциированный с хроматином фермент поли-АДФ-рибозилполимеразу (PARP). Данный фермент вовлечён в реакции репарации ДНК, поврежденной химическими мутагенами, активными формами кислорода и ионизирующей радиацией. Аллель гена ADPRT, который несет трансверсию Т→С в 40 676 положении, приводящую к аминокислотной замене Val762Ala в кодируемом белке, ассоциирован с пониженной способностью связывать XRCC1 и другие белки репарации, сниженной функциональной активностью фермента [5].
В связи с вышесказанным целью исследования стал анализ полиморфизмов генов репарации ДНК XRCC1, ADPRT, hOGG1 у представителей коренного (шорцы) и пришлого населения (русские) Кемеровской области.
Материалы и методы
Исследуемая выборка включала 263 человека (123 мальчика и 140 девочек, средний возраст 12,81±0,18 лет). Среди них: шорцев - 143 человек, русских - 120 человек (из них 54 человека проживает в школе-интернате г. Таштагол Кемеровской области (КО), 28 человек проживает в с. Красное Ленинск-Кузнецкого района и 38 - в с. Пача Яшкинского района Кемеровской области).
Все обследованные доноры не имели хронических заболеваний в стадии обострения. На каждого обследуемого ребенка был оформлен протокол информированного согласия, подписанный родителями либо лицами, осуществляющими опеку несовершеннолетних.
Для выполнения молекулярно-генетических исследований забирали венозную кровь на антикоагулянте (0,25 мМ ЭДТА-Na), с последующим получением лейковзвеси. Выделение ДНК из этого биологического материала проводили методом фенол-хлороформной экстракции [6]. Образцы ДНК растворяли в 10 mM Tris/1 EDTA, pH 8.0 и хранили при -20 oC.
Для типирования полиморфизмов генов использовали коммерческую тест-систему «SNP-express» (НПФ «Литех», г. Москва). ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Россия) по программе, рекомендованной производителем набора. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в горизонтальном 3%-ном агарозном геле. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.
Статистический анализ первичных данных осуществляли средствами STATISTICA for WINDOWS v.8.0. Оценку достоверности различий в распределении полиморфных вариантов проводили стандартным методом χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. Оценку соответствия распределений полиморфных вариантов равновесию Харди-Вайнберга осуществляли с использованием доступного интернет-ресурса: http:// www.genes.org.uk/software/hardy-weinberg.shtml.
Результаты и обсуждение
В изученных выборках детей распределения частот аллелей и генотипов изученных полиморфных маркеров не имели отклонений от равновесия Харди-Вайнберга. Полученные значения частот аллелей и генотипов у шорцев и русских представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Полиморфизм генов эксцизионной репарации оснований ДНК у шорцев и русских
|
Генотип
|
Русские n (%) |
Шорцы n (%) |
|
XRCC1 Arg194Trp |
||
|
Arg/ Arg |
120 (84,51) |
103 (85,83) |
|
Arg /Trp |
22 (15,49) |
16 (13,33) |
|
Trp / Trp |
0 |
1 (0,83) |
|
XRCC1 Arg280His |
||
|
Arg / Arg |
123 (86,01) |
97 (85,09) |
|
Arg / His |
20 (13,00) |
17 (14,91) |
|
His / His |
0 |
0 |
|
XRCC1 Arg399Gln |
||
|
Arg / Arg |
49 (44,95) |
69 (53,49) |
|
Arg / Gln |
44 (40,37) |
52 (40,31) |
|
Gln/ Gln |
16 (14,68) |
8 (6,20) |
|
hOGG1 Ser326Cys |
||
|
Ser/Ser |
56 (56,57)* |
37 (27,61) |
|
Ser/Cys |
37 (37,37)* |
73 (54,48) |
|
Cys/Cys |
6 (6,06)* |
24 (17,91) |
|
ADPRT Val762Ala |
||
|
Val/Val |
40 (28,37)* |
60 (53,57) |
|
Val/Ala |
71 (50,35) |
44 (39,29) |
|
Ala/Ala |
30 (21,28)* |
8 (7,14) |
* р<0.05.
При сравнении представителей коренного (шорцы) и пришлого (русские) населения КО были выявлены статистически значимые отличия в распределении генотипов гена hOGG1: Ser/Ser (χ2=18,71; р=0,00001), Ser/Cys (χ2 =6,01; р=0,01), Cys/Cys (χ2=19,58; p=0,00001) и генотипов ADPRT Val/Val (χ2 =15,55; р=0,0001) и Ala/Ala (χ2=8,69; р=0,003). Аллель hOGG1 Cys в 1,8 раза чаще встречается в группе шорцев, чем в группе русских (χ2=19,58; p=0,00001). Аллель ADPRT Ala в группе шорцев встречался в 1,7 раза чаще, чем в группе русских (χ2=19,72; p=0,00001). Отличий в распределении генотипов и аллелей гена XRCC1 в группах шорцев и русских выявлено не было.
Сравнение представленных в таблице результатов с данными литературы позволило выявить некоторые особенности. Для большинства исследованных маркеров выявлено сходство распределения генотипов у шорцев и монголоидов, у русских и представителей белой расы - европеоидов. Однако у этого общего правила наблюдались и некоторые исключения.
Было установлено, что у русских КО повышена частота минорного аллеля His гена XRCC1 Arg280His (7,5%), тогда как в группе, например, жителей Норвегии она составила 4,0% [10], у белых США - 4,4% [7]. Кроме того, в группе русских КО повышена частота минорного аллеля Ala гена ADPRT - 7,14%, тогда как в группах европеоидов США, Мексики, Нидерландов она составила 2,80%; 1,63% и 2,2% соответственно [1; 3; 4].
В группе шорцев оказалась снижена частота встречаемости минорного аллеля Trp гена XRCC1 Arg194Trp (7,7%), тогда как в группах, например, китайцев и жителей Тайваня она составила 28,8% и 24,5% соответственно [2].
Заключение
Для выявления генетических маркеров риска развития мультифакториальных заболеваний или маркеров повышенной чувствительности организма к тем или иным неблагоприятным факторам (токсикантам, радиации, инфекционным агентам и пр.) необходимо опираться на точную информацию о популяционных частотах генотипов выбранных маркеров. В данной работе представлен один из первых этапов оценки популяционных частот генотипов генов репарации у жителей Кемеровской области.
Получены «ориентировочные» (пока малый объем выборок не позволяет делать окончательное заключение) оценки популяционных частот генотипов генов эксцизионной репарации оснований ДНК в группах детей коренного (шорцы) и пришлого населения (русские) Кемеровской области. Выявлены этноспецифические особенности в распределении генотипов. У шорцев наблюдалась повышенная по сравнению с русскими частота встречаемости минорных аллелей hOGG1 Cys и ADPRT Ala, кодирующих ферменты со сниженной функциональной активностью.
Работа поддержана государственным контрактом ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» № 16.512.11.2062; грантом РФФИ, 10-04-00497-а.
Рецензенты:
- Начева Л.В., д.б.н., профессор, зав. кафедрой Общей биологии с основами генетики и паразитологии, ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Кемерово.
- Маюрникова Л.А., д.т.н., профессор, зав. кафедрой Технологии и организации общественного питания ГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» Министерства образования и науки РФ, г. Кемерово.
Работа получена 11.10.2011