STUDY OF THE NEW COMBINED MIXTURE OF MICROORGANISMS ANTIMICROBIAL IN VITRO

Важнейшей проблемой современной медицины стало массовое распространение лекарственной устойчивости у условно-патогенных бактерий и грибов. Одним из направлений ее преодоления явилось комбинированное применение антибиотиков с другими веществами. По данным разных авторов установлено следующее: флавоны в субингибирующих концентрациях повышают чувствительность MRSA к бета-лактамным антибиотикам [10], комбинации сульфаниламидов с солями серебра преодолевают резистентность бактерий [1], метаноловый экстракт граната и антибиотик (левомицетина, гентамицина, тетрациклина, ампициллина и оксациллина) подавляют MRSA-штаммы in vitro [9], тетрациклин и этаноловый экстракт листьев, плодов и других частей десяти индийских лекарственных растений преодолевают устойчивость полирезистентных стафилококков [7], алкалоиды некоторых растений способны подавлять системы эффлюкса, отвечающие за множественную лекарственную устойчивость бактерий [8]. «Способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий и грибов» [2], основанный на синергизме анилиновых красителей (в субингибирующих концентрациях), не обладающих антимикробными свойствами, и химиотерапевтических лекарственных средств, неэффективных вследствие лекарственной устойчивости микробов (в средних терапевтических дозах), является одним из них.

Цель исследования

Изучить действие комбинированных антимикробных рецептур на полирезистентные бактерии и грибы in vitro.

Материал и методы исследования

В исследованиях использовали коллекцию полирезистентных клинических изолятов, хранившихся в лаборатории кафедры общей и военной эпидемиологии ГОУ ВПО «Самарский военно-медицинский институт МО РФ». Оценка размеров зон подавления роста различных условно-патогенных бактерий и грибов комбинированными антимикробными рецептурами определялась диско-диффузионным методом, руководствуясь общепринятыми методиками [3; 4], инструкциями производителей бумажных дисков. В качестве основы питательной среды применяли МПА, в состав которого вводили 0,00125% бриллиантового зеленого, либо 0,0025% метиленового синего (фуксина основного). После инокуляции поверхности агара на него накладывали бумажные диски, содержащие по 20 мг различных антимикробных препаратов (антибиотиков, фурагина и ципрофлоксацина). В контроле (с тем же инокулятом) питательная среда не содержала анилинового красителя. Культивирование проводили в течение одних суток. Статистическая обработка результатов исследований проводилась по методике В.И. Юнкерова [6].

Результаты исследования и их обсуждение

При испытании способа преодоления лекарственной устойчивости в отношении коринебактерий (таблица 1) установлено, что зоны подавления роста комбинациями антимикробных препаратов с анилиновыми красителями многократно превышали таковые в контроле. Отличия в долях подавляемых штаммов одним и тем же химиопрепаратом при сочетании с разными анилиновыми красителями оказались статистически недостоверными (р > 0,05). Та же закономерность выявлена при сравнении долей штаммов коринебактерий, рост которых ингибировался сочетанием одного и того же красителя с различными химиопрепаратами. Это свидетельствует об универсальности разработанного способа преодоления лекарственной устойчивости микробов. Несмотря на отсутствие статистически значимых отличий, наиболее эффективными оказались комбинации антимикробных препаратов с метиленовым синим (подавлялся рост 70-100% резистентных штаммов); в меньшей степени - с фуксином (подавлялся рост только 60-83% из них). У антибиотиков комбинирование эритромицина с метиленовым синим и бриллиантовым зеленым приводило к подавлению роста 100% исследованных штаммов коринебактерий, с гентамицином - 90%, а с доксициклином и ципрофлоксацином - всего 70 и 77-85% соответственно.

Таблица 1 - Активность комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении Corynebacterium spp.

Антимикробный препарат	n	Результаты
Антимикробный препарат	n	контроль (без красителя)	фуксин	бриллианто-вый зеленый	метилено-вый синий
Левомицетин	12	7,4±3,0	23,2±2,9 83	24,0±2,2 92	20,9±2,7 75
Эритромицин	10	1,5±2,3	23,7±5,0 80	29,4±5,7 100	24,0±4,2 100
Доксициклин	10	2,3±3,5	18,7±7,1 60	21,3±5,3 70	21,5±5,0 70
Гентамицин	10	7,7±3,8	22,0 ±7,8 80	24,0±4,5 90	21,2 ±3,2 90
Ципрофлоксацин	13	4,4±3,8	21,3±6,3 62	29,6±6,0 85	24,1±3,3 77
Фурагин	14	6,1±3,8	31,4±7,7 70	27,5±4,4 86	27,0±5,0 87
Примечания. n - количество исследованных штаммов. В поле таблицы в числителе указаны диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое в мм и доверительный интервал для Р = 95), в знаменателе - доля штаммов (в процентах), в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя. Визуальных признаков ингибирования роста анилиновыми красителями (в применявшихся концентрациях) не установлено в отношении всех исследованных штаммов.

Подобные данные получены при сравнительном анализе подавления роста золотистого и эпидермального стафилококков (таблицы 2 и 3).

Таблица 2 - Активность комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении Staphylococcus aureus

Антимикробный препарат	n	Результаты
Антимикробный препарат	n	контроль (без красителя)	фуксин	бриллиантовый зеленый	метиленовый синий
Эритромицин	13	2,1±2,5	33,8±8,6 67	25,9±2,9 92	22,2±1,5 92
Доксициклин	14	3,0±2,9	37,3±16,3 57	25,5±3,6 86	19,5±2,1 86
Гентамицин	14	4,2±3,0	28,1±6,2 67	24,3±2,2 93	21,4±1,6 93
Цефазолин	8	8,4±6,0	28,0±4,6 88	24,6±2,8 88	21,1±2,7 88
Ципрофлоксацин	13	5,0±3,5	30,2±8,3 62	29,0±4,4 85	22,3±2,2 69
Фурагин	11	7,2±3,8	25,9±6,3 64	24,4±2,6 82	22,2±1,7 82
Примечания. n - количество исследованных штаммов. В поле таблицы в числителе указаны диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое в мм и доверительный интервал для Р = 95), в знаменателе - доля штаммов (в процентах), в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя. Визуальных признаков ингибирования роста анилиновыми красителями (в применявшихся концентрациях) не установлено в отношении всех исследованных штаммов.

Таблица 3 - Активность комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении Staphylococcus epidermidis

Антимикробный препарат	n	Результаты
Антимикробный препарат	n	контроль (без красителя)	фуксин	бриллиантовый зеленый	метиленовый синий
Левомицетин	10	5,6±4,4	20,5±5,4 60	24,1±4,7 90	22,9±3,2 80
Эритромицин	12	4,5±3,6	29,6±10,3 67	31,8±9,9 67	26,5±5,9 67
Доксициклин	11	4,3±4,0	20,8±6,3 55	33,6±11,1 73	25,0±6,2 73
Гентамицин	10	3,9±3,7	17,5±3,3 40	24,1±4,8 70	26,5±5,9 70
Цефазолин	10	6,7±4,2	26,6±4,8 70	30,9±8,9 70	21,3±3,0 70
Ципрофлоксацин	12	5,3±3,6	28,4±5,3 67	28,3±6,4 83	27,6±3,9 92
Фурагин	11	5,0±3,9	20,7±3,2 82	32,8±6,7 73	28,3±3,6 73
Примечания. n - количество исследованных штаммов. В поле таблицы в числителе указаны диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое в мм и доверительный интервал для Р = 95), в знаменателе - доля штаммов (в процентах), в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя. Визуальных признаков ингибирования роста анилиновыми красителями (в применявшихся концентрациях) не установлено в отношении всех исследованных штаммов.

Оценка эффективности способа преодоления лекарственной устойчивости применительно к энтеробактериям (клебсиелле, энтеробактерам) каких-либо закономерностей и тенденций при сравнении активности различных красителей установить не позволила (таблицы 4 и 5).

Таблица 4 - Активность комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении Klebsiella pneumoniae

Антимикробный препарат	n	Результаты
Антимикробный препарат	n	контроль (без красителя)	фуксин	бриллиантовый зеленый	метиленовый синий
Доксициклин	10	3,8±3,5	21,8±5,1 50	22,0±3,6 60	22,3±3,6 60
Цефазолин	10	5,4±4,1	16,7±3,8 30	32,2±15,3 60	22,0±4,3 40
Ципрофлоксацин	8	5,5±5,0	16,7±5,2 25	24,0±5,0 62	21,0±6,6 50
Фурагин	9	6,6±4,8	20,0±4,5 44	22,6±6,0 56	22,0±5,2 56
Примечания. n - количество исследованных штаммов. В поле таблицы в числителе указаны диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое в мм и доверительный интервал для Р = 95), в знаменателе - доля штаммов (в процентах), в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя. Визуальных признаков ингибирования роста анилиновыми красителями (в применявшихся концентрациях) не установлено в отношении всех исследованных штаммов.

Таблица 5 - Результаты оценки активности комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении Enterobacter spp.

Антимикробный препарат	n	Результаты
Антимикробный препарат	n	контроль (без красителя)	фуксин	бриллиантовый зеленый	метиленовый синий
Доксициклин	10	3,6±3,4	22,0±4,6 50	25,8±3,2 50	19,0±3,9 50
Гентамицин	8	6,3±4,5	23, 24 25	21,0±4,3 50	19,8±3,5 50
Фурагин	10	6,8±4,3	19, 24 20	22,8±2,7 40	22,0±4,7 40
Примечания. n - количество исследованных штаммов. В поле таблицы в числителе указаны диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое в мм и доверительный интервал для Р = 95), в знаменателе - доля штаммов (в процентах), в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя. Визуальных признаков ингибирования роста анилиновыми красителями (в применявшихся концентрациях) не установлено в отношении всех исследованных штаммов.

Наиболее высокая эффективность достигнута в преодолении лекарственной устойчивости к доксициклину (50-60%), ципрофлоксацину (50-62%) с метиленовым синим и бриллиантовым зеленым.

При анализе результатов проведенных исследований обращала на себя внимание значительно более низкая эффективность преодоления лекарственной устойчивости грамотрицательных бактерий по сравнению с грамположительными. Эффективность преодоления резистентности к химиопрепаратам у грамположительных бактерий (коринебактерий и стафилококков) достоверно превышала таковую у грамотрицательных (клебсиеллы и энтеробактеров). Полученные нами данные соответствуют сведениям И.М. Романенко с соавт. [5] о том, что анилиновые красители действуют преимущественно на грамположительные микроорганизмы.

Применение метиленового синего и бриллиантового зеленого позволяло преодолеть резистентность к итраконазолу, кетоконазолу и флуконазолу у всех устойчивых к ним клинических изолятов Candida albicans, хранившихся в нашей коллекции (таблица 6).

Таблица 6 - Активность комбинаций антимикробных препаратов с анилиновыми красителями в отношении грибов Candida albicans

Антимикробный препарат	n	Результаты
Антимикробный препарат	n	контроль (без красителя)	метиленовый синий	бриллиантовый зеленый
Итраконазол	6	7,7±6,4	21,3±5,0 100	22,3±2,9 100
Флуконазол	11	4,9±3,8	21,5±2,6 100	22,2±2,2 100
Кетоконазол	7	6,7±5,8	21,7±4,6 100	21,7±3,6 100
Примечания. n - количество исследованных штаммов. В поле таблицы в числителе указаны диаметры зон подавления роста штаммов, проявивших чувствительность к действию антимикробного препарата и красителя (среднее арифметическое в мм и доверительный интервал для Р = 95), в знаменателе - доля штаммов (в процентах), в отношении которых проявлялся синергизм действия антимикробного препарата и красителя. Визуальных признаков ингибирования роста анилиновыми красителями (в применявшихся концентрациях) не установлено в отношении всех исследованных штаммов.

Выводы

Таким образом, получаемые результаты показали универсальность предлагаемого способа преодоления лекарственной устойчивости: эффективность комбинированных препаратов существенным образом не зависит от используемого антимикробного средства и красителя. Эффективность разработанного способа преодоления лекарственной устойчивости микробов для комбинаций антимикробных препаратов с бриллиантовым зеленым и метиленовым синим в отношении стафилококков и коринебактерий составила 67-100%, энтеробактерий - 40-62%, грибов Candida albicans - 100%.

Рецензенты:

Кулагин О.Л., д.м.н., профессор, профессор кафедры фармакологии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Минздрава», г. Самара.
Жестков А.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Минздрава», г. Самара.

Работа получена 15.08.2011

Scientific journal
Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

STUDY OF THE NEW COMBINED MIXTURE OF MICROORGANISMS ANTIMICROBIAL IN VITRO

Modern problems of science and education
Scientific journal | ISSN 2070-7428 | CertJournal