В связи с появлением резистентных и полирезистентных форм микроорганизмов к имеющимся антибактериальным препаратам значительно повысился интерес к повышению эффективности уже используемых лекарственных средств и расширению спектра действия. Антибактериальные химиотерапевтические средства, кроме антибиотиков, представлены также препаратами других классов химических веществ с различным механизмом антимикробного действия.
В настоящие время достаточно широко используются комбинированные препараты, в состав которых обычно входят два антимикробных средства, иногда три. Такой выбор сочетаний предусматривает: потенцирование активности по сравнению с действием одного препарата в монотерапии; расширения спектра действия, включая активность и в отношении резистентных штаммов к тому или другому компоненту в сочетании; возможность снижения частоты развития лекарственной устойчивости к определенной группе антимикробных препаратов; улучшение переносимости лекарств, уменьшение частоты и тяжести побочных реакций, и в первую очередь за счет снижения лечебных доз препаратов.
Одним из таких препаратов, который привлек наше внимание, является ко-тримоксазол, представляющий собой сочетание сульфаниламида с производным диаминапиримидина, потенциирующего действие сульфаниламида. Кроме того, производные сульфаниламида помимо антибактериальной активности характеризуются и антипротозойным действием.
Производные сульфаниламида являются «основоположниками» этиотропного лечения бактериальных инфекций, в том числе в монотерапии. В связи с огромными успехами в синтезе новых высокоэффективных и малотоксичных антимикробных препаратов в других классах химиотерапевтических веществ значение производных сульфаниламида существенно уменьшилось, но, тем не менее, ряд препаратов этой группы остаются в арсенале врачей и при хорошей переносимости при легких и среднетяжелых формах инфекции могут применяться в монотерапии в соответствии с чувствительностью возбудителя инфекции. К недостаткам производных сульфаниламида относится достаточно быстрое развитие к ним лекарственной устойчивости бактерий по типу плазмидной, быстрое распространение лекарственно-устойчивых штаммов, перекрестная устойчивость в пределах данной группы препаратов, высокие лечебные дозы для производных сульфаниламида короткого действия, ряд побочных реакций.
Другой группой химиотерапевтических средств, нарушающих нормальный синтез фолиевых кислот, являются производные диаминопиримидина. Спектр их действия включает большую группу грамположительных и грамотрицательных бактерий и простейших. К производным диаминопиримидина также достаточно быстро развивается лекарственная устойчивость. Существенной при сочетании производных диаминопиримидина с производными сульфаниламида является возможность снижения дозировок каждого из препаратов. Производные диаминопиримидина могут потенцировать по принципу двойной мишени активность соединений других классов химиотерапевтических веществ: хинолонов, фторхинолонов, тетрациклинов и др., но наиболее практическое значение они приобрели как потенциаторы действия производных сульфаниламидов.
В связи с этим с помощью химической модификации нами были получены производные сульфаниламида и диаминопиримидина с целью наиболее рационального использования этих веществ. Поэтому целью исследования явилось изучение биологической активности новых производных in vivo и in vitro.
Для решения поставленных задач применен комплекс микробиологических, иммунологических, физико-химических методов.
Антибактериальную активность лигандов, а также их комплексных соединений и лекарственных форм, приготовленных на их основе, в отношении факультативно анаэробных микроорганизмов определяли in vitro методом диффузии в агар (Государственная Фармакопея, XI изд-е, 1990). В соответствии с рекомендациями ВОЗ и ГФ для оценки активности новых биокомплексов в качестве тест-культур использовали штаммы факультативно-анаэробных бактерий и грибов из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Москва): StaphylococcusaureusATCC 25923, Staphylococcusaureus 209-Р, BacillussubtilisATCC 6633, Bacilluscereus ATCC 10702, Escherichiacoli ATCC 25922, Proteusvulgaris ATCC 4636, PseudomonasaeruginosaATCC 27853, CandidaalbicansNCTC 2625.
Биологическую активность биокомплексов in vivo изучали на белых мышах (весом 18-20 г) при моделировании стафилококковой инфекции. Для этого мышей внутрибрюшинно заражали суточной агаровой культурой Staphylococcusaureus № 554, в дозе, вызывающей гибель 50 % мышей в течение 7 суток (1х107 микробных тел/мл), и через сутки после заражения в течение 7 дней ежедневно внутримышечно вводили исследуемые препараты. Терапевтическую эффективность биокомплексов оценивали по выживаемости животных.
Для оценки состояния антиинфекционной защиты организма определяли: фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, завершенность фагоцитоза [2], показатели активности кислородзависимых и кислороднезависимых бактерицидных систем нейтрофилов [3, 4], уровень сывороточного лизоцима [5], бактерицидную активность сыворотки крови [5], показатели спонтанных Е-РОК [6]. Все полученные данные подвергнуты статистической обработке с определением критерия Стьюдента.
Основным подходом в создании лекарственных средств антимикробного назначения является поиск мягкодействующих на организм человека лекарственных препаратов, не оказывающих резких изменений основных функций организма и обладающих лечебным эффектом, но при этом не вызывающих резистентность у микроорганизмов.
Однако возможности для открытия новых групп препаратов, по мнению многих исследователей, практически исчерпаны и поэтому основные усилия должны быть направлены на повышение биологической активности имеющихся лекарственных средств. Химическая модификация - один из путей повышения биологической активности и расширения спектра их действия.
Для химической модификации нами были выбраны два производных сульфаниламида и диаминопиримидина, обладающих химиотерапевтической активностью при инфекциях, вызванных грамположительными и грамотрицательными бактериями, некоторыми простейшими, хламидиями и оказывающих бактериостатическое действие.
Бактерицидный эффект этих соединений связан с двойным блокирующим действием на метаболизм бактерий. Производное сульфаниламида нарушает биосинтез дигидрофолевой кислоты, а производное диаминопиримидина блокирует следующую стадию метаболизма-восстановления дигидрофолиевой кислоты в необходимую для развития микроорганизмов тетрагидрофолиевую кислоту. Выбор производного сульфаниламида в качестве компонента вызван тем, что он имеет одинаковую скорость элиминации с производным диаминопиримидина.
Препарат эффективен в отношении стрептококков, палочки дизентерии, брюшного тифа, кишечной палочки, протея и неэффективен в отношении микобактерий туберкулеза, спирохет, синегнойной палочки. Эти данные явились предпосылками к химическому синтезу и изучению антимикробной активности новых производных сульфаниламида (шифр соединений:Sm, Sm-27, Sm-29, Sm-30) и диаминопиримидина (шифр соединений: Tmp, Tmp-27, Tmp-29, Tmp-30).
Проведенные исследования показали, что химическая модификация изучаемых лиганд позволяет увеличивать их антимикробную активность (таблица 1). Изучаемые новые производные сульфаниламида и диаминопиримидина в отношении всех изученных тест-микробов проявляли более высокую антимикробную активность по сравнению с лигандами, так как в отношении изучаемых микроорганизмов значимо увеличивался.
Таблица 1. Антимикробная активность лиганд и новых производных в отношении факультативно анаэробных микроорганизмов
|
Тест-культура |
Диаметр зоны задержки роста бактерий препаратами в мм (М±m) |
|||||||
|
Sm |
Sm-27 |
Sm-29 |
Sm-30 |
Tmp |
Tmp-27 |
Tmp-29 |
Tmp-30 |
|
|
S.aureus 209-Р |
16,0±0,4 |
30,1±0,4 |
34,4±0,5 |
36,2±0,5 |
17,1±0,3 |
32,2±0,4 |
32,5±0,3 |
35,4±0,4 |
|
S. aureus ATCC 25923 |
18,0±0,3 |
31,2±0,3 |
33,4±0,3 |
35,5±0,4 |
17,6±0,2 |
34,0±0,3 |
33,1±0,4 |
36,2±0,3 |
|
B. subtilis ATCC 6633 |
12,0±0,2 |
28,0±0,3 |
27,1±0,4 |
29,2,±0,3 |
12,4±0,2 |
27,9±0,2 |
28,4±0,5 |
28,9±0,3 |
|
E.coli ATCC 25922 |
19,6±0,3 |
34,7±0,4 |
35,8±0,4 |
50,1±0,5 |
23,4±0,3 |
38,7±0,3 |
40,2±0,4 |
39,5±0,3 |
|
P. aeruginosa ATCC 27853 |
13,1±0,2 |
23,8±0,3 |
25,6±0,4 |
24,2±0,3 |
8,1±0,2 |
25,4±0,2 |
27,4±0,3 |
29,3±0,4 |
|
C. albicans NCTC 2625 |
8,2±0,2 |
20,1±0,4 |
24,3±0,3 |
23,5±0,2 |
8,0±0,3 |
21,9±0,4 |
25,1±0,2 |
25,2±0,3 |
Примечание: Sm- лиганд (производное сульфаниламида); Sm-27, Sm-29, Sm-30 - химически модифицированные производные сульфаниламида; различие данных по отношению к лиганду достоверны (р<0,05); Tmp - лиганд (производное диаминопиримидина); Tmp-27, Tmp-29, Tmp-30 - химически модифицированные производные диаминопиримидина; различие данных по отношению к лиганду достоверны (р<0,05).
Это можно объяснить тем, что химическая модификация исходных лиганд позволяет получить соединения, оказывающие влияние на специфическую активность лиганд.
Очень важной характеристикой антибактериальных препаратов являются их характер действия (бактерицидный или бактериостатический) и определение минимальной бактерицидной концентрации. Это связано с тем, то увеличение концентрации, как производного сульфаниламида, так и производного диаминопиримидина, может сопровождаться различными побочными эффектами: невропатией, аллергическими реакциями, диареей. Поэтому важно было, чтобы синтезированные новые производные по минимальной бактерицидной концентрации, как минимум, не уступали исходному лиганду. Определение минимальных подавляющих концентраций для изучаемых производных сульфаниламида и диаиминопиримидина выявило их изменение в диапазоне от 0,31 мг/мл до 2,5 мг/мл в отношении исследованных штаммов.
Поскольку далеко не всегда антимикробное действие препарата, установленное invitro, совпадает с его активностью в живом организме, нами было проведено изучение протективной активности новых производных в опытах на мышах при внутрибрюшинном их заражении культурой S. aureus.
Проведенные исследования позволили установить, что при лечении синтезированными производными Sm-27, Sm-29, Sm-30 и Tmp-27, Tmp-29, Tmp-30 выживаемость животных составила от 90,5 % до 98,5 % соответственно.
Поскольку одним из непременных условий эффективной терапии инфекционных процессов является адекватный иммунологический ответ, то представляло интерес изучение воздействия новых производных на показатели антиинфекционной защиты организма экспериментальных животных.
Введение животным химически модифицированных сульфаниламида и диаминопиримидина оказывало существенное влияние на формирование гуморального иммунного ответа, индуцированного эритроцитами барана, о чем свидетельствовало увеличение количества антителообразующих клеток почти в 2 раза.
Одним из важных факторов антиинфекционной защиты, определяющим дальнейшее развитие инфекционного процесса, является ее неспецифическое звено. Полученные результаты исследования влияния новых производных на фагоцитарную активность лейкоцитов показали, что более высокие значения активности фагоцитоза отмечены в группах животных, которым вводили новые производные, так как у них фагоцитарный индекс значительно превышал показатели как контрольной группы, которым вводили физиологический раствор, так и групп, которым вводили лиганды. Показатели НСТ-стимулированного теста, бактерицидной активности сыворотки крови также характеризовались статистически более высокими значениями в группах опытных животных по сравнению с группами контроля.
Таким образом, проведенные исследования показали, что химически модифицированные производные сульфаниламида и диаминопиримидина обладают наиболее выраженными антимикробным действием в отношении изученных тест-штаммов микроорганизмов по сравнению с исходными лигандами; высокой терапевтической активностью при экспериментальной стафилококковой инфекции, заключающейся в достоверном снижении смертности лабораторных животных; оказывают стимулирующее действие на факторы неспецифической резистентности (фагоцитоз, бактерицидную активность сыворотки крови) и гуморального иммунного ответа.
Рецензенты:
- Калуцкий П.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России, г. Курск.
- Ляшев Ю.Д., д.м.н., профессор кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России, г. Курск.
Работа получена 25.08.2011.