Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Введение

С каждым годом по мере старения населения и изменения образа жизни растут показатели распространенности и смертности от злокачественных опухолей [1]. Хотя хирургические пособия остаются одним из основных методов лечения злокачественных новообразований, их эффективность снижается на поздних стадиях опухолевого процесса. К счастью, химиотерапия и целевые терапевтические препараты дают надежду таким онкологическим больным [2]. Кожная меланома (КМ) – очень агрессивное злокачественное новообразование, возникающее из меланоцитов. В промышленно развитых странах наблюдается постоянный рост заболеваемости КМ, при этом чаще всего она диагностируется у людей молодого и среднего возраста [3]. Ранняя диагностика опухоли и последующее хирургическое лечение обычно приводят к выздоровлению. КМ, которая не распознается клинически, часто проявляется на поздней стадии, практически не поддается традиционным методам лечения и имеет неблагоприятный прогноз. Для повышения эффективности используемых в настоящее время схем лечения КМ и преодоления приобретенной резистентности опухоли необходимы новые молекулярные мишени и стратегии лечения [4].

Рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor – EGFR) имеет важное значение для клеточной пролиферации, дифференцировки, деления и развития клеток, в том числе злокачественных, способствуя их лекарственной устойчивости [5]. Этот рецептор был обнаружен практически во всех органах и тканях, в том числе и в нормальных меланоцитах кожи, однако экспрессия его здесь низкая [6]. Злокачественные опухоли кожи также часто характеризуются наличием EGFR. Установлено, что экспрессия EGFR повышена при некоторых формах базально-клеточной карциномы кожи [7]. Узловые КМ экспрессируют мембранную EGFR в 50% случаев, а многие образцы демонстрируют одновременную экспрессию мембранных и ядерных рецепторов. Было установлено, что EGFR экспрессируются только в подгруппе КМ с плохим прогнозом и влияют на метастатическую инвазию в сторожевые лимфатические узлы [8]. Амплификация копий генов EGFR также была связана с прогрессированием КМ и метастазированием [9]. Следовательно, EGFR может быть мишенью для таргетной терапии КМ. Немногочисленные данные о клинической эффективности ингибиторов EGFR при КМ обусловливают дальнейшее изучение способов прямого или косвенного подавления сверхэкспрессии этого рецептора у пациентов, особенно при прогрессировании онкологического заболевания [10].

Цель исследования – предварительная оценка противоопухолевой эффективности нового блокатора внутреннего домена EGFR (производного пиримидин-4-она) в эксперименте.

Материал и методы исследования Пятигорским медико-фармацевтическим институтом были предоставлены образцы нового блокатора внутреннего домена EGFR (PMSoVn) в виде мелкодисперсной коллоидной смеси на носителе (поливинилпиромидоне). Смесь имеет слабо-желтый цвет, прозрачна, водорастворима, без запаха. Синтез 2-винилензамещенных производных осуществляли путем взаимодействия соединения сулифамидного производного пиримидин-4(1Н)она с соответствующими альдегидами в среде этанола и диметилформамида по схеме синтеза (рис. 1).

Рис. 1. Схема синтеза 2-винилензамещенных производного 4-{2-[2-(2-гидрокси-3-метоксифенил)-винил]-6-метил-4-оксо-5-фенил-4H-пиримидин-1-ил}-бензсульфамида (PMSoVn)

Исходный 4-(2,6-диметил-4-оксо-5-фенил-4H-пиримидин-1-ил) бензсульфамид в количестве 0,01 моль растворяли при нагревании в диметилформамиде. Далее прибавляли эквимолярное количество о-ванилина в 3 мл этанола. Реакционную смесь кипятили в течение 3 часов. Выделившийся при охлаждении реакционной среды осадок отфильтровывали и промывали водой. Полученный PMSoVn очищали перекристаллизацией из смеси этанола и ДМСО. Выход PMSoVn составил 68%, температура плавления 301–302°С. Вещество представляет собой желтый кристаллический порошок без запаха. ИК-спектры, см–1: 1632, 1609, 1581. Уф-спектр λmax: 214, 253, 322 нм (С-1∙10-5 моль /л в этаноле). ВЭЖХ: 99,8%. Растворим в диметилформамиде, диметилсульфоксиде, этаноле. Для улучшения растворимости PMSoVn в воде его соединяли с полимером-носителем – низкомолекулярным медицинским поливинилпирролидоном ФС 42-1194-98, а также в качестве поверхностно-активного вещества добавляли додецилсульфат-натрия.

Доклиническое изучение противоопухолевой активности PMSoVn проведено на 60 мышах линии С57BL/6, массой 25 г, которые поступили из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» (филиал «Андреевка», Московская область). У мышей был свободный доступ к воде и пище, естественный режим освещения. Работа с животными осуществлялась в соответствии с правилами «Европейской конвенции о защите животных, используемых в экспериментах» (Директива 86/609/ЕЕС) и Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных.

Мыши были разделены на три экспериментальные группы: основную, группу сравнения и контрольную – по 10 животных обоего пола в каждой. Всем животным перевивали меланому В16/F10 в подлопаточную область справа в разведении с физиологическим раствором 1:10 объемом 0,5 мл (штамм был получен из НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина, г. Москва). Меланома В16/F10 является одной из обязательных опухолей, рекомендованной при изучении противоопухолевых действий новых фармакологических средств с противоопухолевой активностью [11, с. 640–654].

Через 6 часов после перевивки опухоли всем животным начали осуществлять введение. Мышам основной группы был введен новый блокатор PMSoVn внутримышечно в разовой дозе 0,375 мг/мышь в день (в расчете на массу мыши 18,75 мг/кг), растворенный ex tempore в 0,3 мл воды для инъекции. Животным группы сравнения перорально был введен осимертиниб (Тагрисса) – блокатор внутреннего домена EGFR – в дозе 0,86 мг/мышь в день (в расчете на массу мыши 42,86 мг/кг, исходя из рекомендаций для людей в пересчете на мышь). Животным контрольной группы вводили воду для инъекций в том же количестве и тем же путем, что и животным основной группы. Введения осуществляли ежедневно 1 раз в день в течение 4 дней. Состояние животных оценивали ежедневно, оценку динамики веса животных и объема подкожных опухолей осуществляли 2 раза в неделю на протяжении всего исследования.

Противоопухолевую эффективность новой субстанции оценивали по ТРО% – торможению роста опухоли – и УПЖ% – увеличению продолжительности жизни. Объем опухолей (V) определяли по формуле: а ˣ в ˣ с, где а, в, с – линейные размеры опухоли, измеренные в трех взаимно перпендикулярных направлениях; ТРО% рассчитывали как отношение V контроля – V опыта) к V контроля, умноженное на 100%, где V контроля – среднегрупповой объем опухоли в определенный момент времени в контрольной группе животных, V опыта – среднегрупповой объем опухоли в определенный момент времени у мышей основной группы; УПЖ% рассчитывали как отношение СПЖ опыта – СПЖ контроля) к СПЖ контроля, умноженное на 100%, где СПЖ опыта – среднегрупповая продолжительность жизни животных в опытной группе; СПЖ контроля – среднегрупповая продолжительность жизни животных в контрольной группе. Значения ТРО% ≥20–50% и УПЖ% ≥25% принимали за значимые [11, 12].

Статистическую обработку результатов проводили посредством программы Statistica 12. С помощью критерия Шапиро–Уилка оценивали нормальность распределения данных. Результаты представлены в виде среднего значения ± ошибка среднего (М±m). Для оценки значимости различий использовали t-критерий Стьюдента, критический уровень значимости принимали р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение Опухоль у мышей начинала визуализироваться на 1-й неделе эксперимента. У 20% самок, получавших PMSoVn, латентный период роста опухоли составил 3 дня, тогда как у остальных мышей – 7 дней. У 60% мышей контрольной группы латентный период составил 3 дня, из них было 40% самок и 20% самцов. В группе сравнения у большинства мышей латентный период составил 7 дней и только у 10% самок – 10 дней (табл. 1).

Таблица 1

Особенности латентного периода и показателей продолжительности жизни мышей (сутки) под влиянием PMSoVn в сравнении с другими экспериментальными группами

Группы	Латентный период (М±m)	Продолжительность жизни
		средняя (М±m)	min	max
Самцы
Меланома В16 + вода	6,20 ±0,80	23,60 ±1,09	14	34
Меланома В16 + осимертиниб	7,00 ±0,0	26,60 ±3,20	21	39
Меланома В16 + PMSoVn	7,00 ±0,00	28,80* ±2,06	19	40
Самки
Меланома В16 + вода	5,40 ±0,98	22,80 ±1,49	15	30
Меланома В16 + осимертиниб	7,6 ±0,6	26,60 ±1,51	16	32
Меланома В16 + PMSoVn	6,20 ±0,80	29,25* ±2,76	19	112 1 самка жива до сих пор

Примечание: * – статистическая значимость отличий относительно соответствующих контрольных значений (р<0,05)

Самая маленькая продолжительность жизни была у мышей контрольной группы – 2 недели (табл. 1). У мышей основной группы и группы сравнения минимальная продолжительность жизни была больше, чем без воздействия: у самок из группы сравнения – на 1 день, а у самок с PMSoVn – на 4 дня; у самцов из группы сравнения – на 4 дня, у самцов из группы с PMSoVn – на 7 дней относительно контроля. Самые маленькие значения максимальной продолжительности жизни также были у самцов и самок мышей контрольной группы – чуть более 4 недель, при этом у самок максимальная продолжительность жизни была на 4 дня короче, чем у самцов (табл. 1). На 2-м месте по максимальной продолжительности жизни располагались мыши группы сравнения – этот показатель у самцов был на 5 дней больше, а у самок – на 2 дня больше, чем у животных соответствующего пола контрольной группы; разница между самцами и самками составила 7 дней. Самая большая максимальная продолжительность жизни регистрировалась у мышей, получавших PMSoVn: у самцов – на 6 дней по сравнению с контролем, что было всего на 1 сутки больше, чем в группе сравнения, одна самка живет до сих пор (табл. 1). Причем максимальный объем опухоли у самки с максимальной продолжительностью жизни был зарегистрирован на 30-е сутки от перевивки опухоли (26-е сутки после окончания лечения) и составил 1,85 см3, после чего опухоль подверглась обратному развитию через некроз. В настоящее время подкожная опухоль не определяется. У всех животных, получавших PMSoVn, средняя продолжительность жизни была больше, чем у мышей контрольной группы: у самцов – на 17,0%, у самок – на 28,3%. Величина средней продолжительности жизни мышей обоего пола, получавших осимертиниб, занимая промежуточное положение между соответствующими значениями показателей основной и контрольной групп, значимо от них не отличалась (табл. 1). Значение УПЖ у самцов, получавших PMSoVn, составило 22,0%, у самок – 28,3%. Следовательно, только у самок мышей, получавших PMSoVn, показатель УПЖ значимо увеличивался по сравнению с контролем, поскольку был больше 25%.

Установлено, что через 7/3 дней значимых отличий по размерам опухолей между группами не было (табл. 2). Через 10/6 дней только у самок мышей, получавших PMSoVn, объем опухолевых узлов был меньше, чем у самок из других групп, – в 5,6 раза по сравнению с контрольной группой и в 3,6 раза по сравнению с группой сравнения. У самцов на этом этапе опухоли были одинакового размера во всех группах. Только в группе с PMSoVn объем опухолей у самцов был в 6,8 раза больше, чем у самок. Через 14/10 дней у самок с PMSoVn по-прежнему объем опухолевых узлов был меньше в 3,1 раза, чем у самок контрольной группы, и в 2,6 раза меньше, чем у самцов основной группы, но при этом значимо не отличался от объема опухолей у самок группы сравнения (табл. 2). Объем подкожных опухолей у самок, получавших осимертиниб, как и в основной группе, был меньше, чем в контроле, в 2,3 раза. Через 17/13 дней эта же закономерность у самок с PMSoVn сохранялась – объем их опухолей был меньше, чем у самок контрольной группы, в 3,1 раза, у самок группы сравнения – в 2,3 раза и у самцов с PMSoVn – в 2,4 раза (табл. 2). Через 21/17 дней после окончания лечения объемы опухолей у самок из группы сравнения и основной группы были меньше, чем у самок контрольной группы: в первом случае – в 2,2 раза, во втором случае – в 2,8 раза; у самцов значимых отличий между группами по этому показателю не было. Только в группе сравнения опухоли у самцов были в 1,4 раза (р<0,05) больше, чем у самок (табл. 2).

Таблица 2

Динамика подкожных опухолевых узлов меланомы В16 (сутки) под влиянием PMSoVn в сравнении с другими экспериментальными группами, М±m

Примечание: Статистическая значимость отличий: р1 – относительно соответствующих значений мышей с меланомой В16 без воздействий; р2 – относительно соответствующих значений мышей с меланомой В16, получавших осимертиниб; р3 – самцов от самок в пределах одной группы (р<0,05).

Через 24/20 дней после окончания лечения у самок из основной группы и группы сравнения объемы опухолей оставались меньше, чем у самок контрольной группы, соответственно в 2,1 раза и в 3,2 раза; у самцов значимых отличий не было. Объемы опухолей у самцов и самок внутри групп не различались (табл. 2).

Поскольку через 27/23 дней в контрольной группе в живых оставалась только 1 самка, провести статистический анализ отличий по сравнению с этой группой не представлялось возможным, тем не менее, объем ее опухоли был в 23,7 раза больше, чем средний объем опухолей у самок в группе с PMSoVn, но в 1,4 раза (р<0,05) меньше, чем средний объем опухолей у самок с осимертинибом (табл. 2). Объем опухолей у самок основной группы был в 32,7 раза меньше, чем у самок группы сравнения, и в 12,8 раза меньше, чем у самцов основной группы. В группе сравнения также оставался 1 самец, поэтому и в этом случае статистический анализ выполнить было невозможно, однако объем опухоли у этого самца не отличался от среднего значения объема опухолей у самцов контрольной группы. У самцов, получавших PMSoVn, объем опухолей был в 2,5 раза меньше, чем у самцов контрольной группы (табл. 2). Через 31/27 дней в живых не осталось ни одной самки контрольной группы, а в группе сравнения была жива только 1 самка, при этом объем ее опухоли был в 7,2 раза больше, чем средний объем опухолей у самок основной группы. Объем опухоли 1 выжившего самца с PMSoVn на 31/27 и 38/34 сутки был соответственно в 8,9 раза и в 9,6 раза больше, чем средний объем опухолей у самок из этой же группы (табл. 2). На 45-е сутки от момента перевивки в живых оставалась 1 самка, получившая PMSoVn, объем ее опухоли на этом сроке составил 0,12 см3, что было в 15,7 раза меньше, чем средний объем опухолей у самок в этой же группе на предыдущем этапе исследований.

У мышей группы сравнения, получавших осимертиниб, через 7/3 дня значение ТРО было максимальным – более 90% (табл. 3). Через 10/6 дней значения ТРО в группе сравнения уменьшались по сравнению с предыдущим периодом: у самцов – на 59,6%, у самок – на 62,8%. Через 14/10 дней у самок ТРО вновь увеличивался на 20,4%, но не достигал максимального значения через 7/3 дней, у самцов величина ТРО снижалась еще больше – на 25,3% по сравнению с 10/6 сутками (табл. 3). Через 17/13 дней у самок значение ТРО вновь снижалось и становилось на 12,2% меньше, чем значение ТРО через 10/6 дней, а у самцов величина ТРО приобретала отрицательные значения, что свидетельствовало о прогрессии опухолевого процесса. Через 21/17 дней у самок группы сравнения значение ТРО вновь увеличивалось до значений через 14/10 дней. У самцов группы сравнения значение ТРО вновь становилось положительным, но не превышало 10%. Через 24/20 дней у мышей группы сравнения сохранялось значение ТРО, характерное для предыдущего периода наблюдения (табл. 3). Через 27/23 дней значение ТРО у самок приобретало отрицательную величину, становясь на 89,3% меньше, чем на предыдущем сроке наблюдения, что свидетельствовало о значительной активации опухолевого роста. У самцов через 27/23 дня величина ТРО, напротив, увеличивалась по сравнению с предыдущим периодом на 10,9%, следовательно, рост опухоли у самцов на заключительном этапе несколько замедлялся.

Таблица 3

Показатель торможения роста опухолей (ТРО, %) у мышей обоего пола под влиянием нового блокатора EGF-R

У мышей основной группы, получавших PMSoVn, значение ТРО через 7/3 дня имело меньшую величину, чем в группе сравнения: у самок – на 52,6%, у самцов – на 38,7% (табл. 3). Следовательно, на этом этапе наблюдения лучшие результаты по торможению роста опухолей отмечались у мышей, получавших осимертиниб, и худшие – у самок мышей, получавших PMSoVn, хотя и у них ТРО был более 50%, что свидетельствовало о хорошем противоопухолевом эффекте обоих препаратов через 3 дня после окончания их введения. Через 10/6 дней у самок основной группы значение ТРО увеличивалось в 1,8 раза по сравнению со значениями через 7/3 дней и становилось на 46,4% больше, чем у самок из группы сравнения, у которых отмечалось снижение этого показателя. У самцов основной группы, напротив, значение ТРО трехкратно уменьшалось по сравнению с предыдущим периодом и становилось на 63,1% меньше, чем у самок основной группы, и на 19,5% меньше, чем у самцов из группы сравнения (табл. 3). Через 14/10 суток показатель ТРО у самок основной группы снижался на 14,6% по сравнению со значениями через 10/6 дней, у самцов – увеличивался на 37%; разница между мышами разного пола с PMSoVn по ТРО составила 11,5%. Следовательно, и у самок, и у самцов мышей основной группы значения ТРО были выше, чем в группе сравнения, соответственно на 10,3% и на 43,2%. Через 17/13 дней значение ТРО у самок основной группы не отличалось от предыдущего периода исследования, а у самцов – резко уменьшалось, становясь ниже минимального значения ТРО через 10/6 дней на 14,7%. Разница между самцами и самками основной группы составила 63,7%. Тем не менее, и у самцов, и у самок с PMSoVn величина ТРО была выше, чем в группе сравнения: у самок на 43,3%, у самцов на 29,7% (табл. 3).

Через 21/17 и 24/20 дней значения ТРО у самок основной группы оставались на прежнем высоком уровне, а у самцов увеличивались по сравнению с минимальным значением через 17/13 суток: через 21/17 сутки – на 22,0%, через 24/20 сутки – на 36,5%. В результате в основной группе значения ТРО у самок были выше, чем у самцов: через 21/17 дней – на 38,4%, через 24/20 дней – на 27,6%. Значения ТРО в основной группе в эти сроки наблюдения превышали соответствующие показатели мышей из группы сравнения: у самок через 21/17 дней – на 11,1%, через 24/20 дней – на 17,0%, у самцов – на 23,3% и на 35,9% соответственно. Через 27/23 суток у самок основной группы отмечалось самое высокое значение ТРО – более 90%, у самцов – более 60%, что было больше, чем в группе сравнения (табл. 3).

Успехи молекулярной онкологии и разработка новых технологий позволили на современном этапе разработать и внедрить в онкологическую практику препараты таргетной направленности, в том числе блокаторы EGFR, которые с успехом применяются для лечения рака легкого, меланомы и некоторых других злокачественных опухолей [13]. К недостаткам блокаторов внутреннего домена EGFR можно отнести исключительно пероральный путь введения, который иногда становится невозможным из-за различных сопутствующих состояний пациентов, связанных с нарушением работы желудочно-кишечного тракта. Кроме того, все препараты с действием, направленным на подавление внутреннего домена EGFR, разработаны за рубежом. Введение санкций в отношении России делает актуальным вопрос импортозамещения лекарственных препаратов для сохранения экономического и технологического суверенитета Российской Федерации. Разработанный Пятигорским фармацевтическим институтом совместно с Ростовским НМИЦ онкологии новый блокатор внутреннего домена EGFR для парентерального введения показал свою противоопухолевую эффективность в отношении экспериментальной меланомы уже на начальном этапе доклинических исследований, что свидетельствует о перспективности его использования в качестве противоопухолевого агента для лечения кожной меланомы.

Следовательно, разработка и последующее внедрение в клиническую практику противоопухолевых препаратов, направленных на блокаду внутреннего домена EGFR, с возможностью парентерального их введения, а также синтезированных на территории Российской Федерации, являются оправданной стратегией.

Заключение Таким образом, вновь синтезированное соединение PMSoVn после 4 дней парентерального введения, показало себя более эффективным в сравнении с известным аналогом – осимертинибом, что делает его кандидатом для дальнейшего доклинического исследования с перспективой внедрения в клиническую практику. Данное исследование носило пилотный характер, считаем целесообразным увеличить длительность введения PMSoVn.