С каждым годом расширяется список белков и пептидов, для которых установлена антимикробная активность. Это и продукты, синтезируемые в кровь нейтрофилами и макрофагами, и макромолекулы, производимые различными типами эпителиальных клеток, и регистрируемые в моче [1‑3]. Среди белков и пептидов с доказанной антимикробной активностью наиболее всесторонне изучен лактоферрин (ЛФ) ‑ железосодержащий белок с молекулярной массой 76 килодальтон, тесты на который в крови, моче и даже в фекалиях широко применяются в медицине, в том числе и в ургентной [4‑6].
Лактоферрин проявляет различные виды активности (антимикробную, противовирусную, фунгицидную, бифидогенную) и необходим организму как фактор роста, а как фермент проявляет РНКазную, ДНКазную, лактопероксидазную и многие другие виды активности. Кроме того, ЛФ различными способами участвует в метаболизме железа [7‑9].
В последние годы обнаружено множество новых функций ЛФ, которые связаны как с целой макромолекулой лактоферрина, так и с ее определенными фрагментами. Так, например, при ферментативном гидролизе лактоферрина человека образуется пептид, названный лактоферрицином (ЛФцин), который оказался более активным в уничтожении различных штаммов бактерий, чем интактный ЛФ [2, 10, 11]. Первичная структура ЛФцина представляет собой короткий пептид из 25 аминокислот, соответствующих 17‑41 аминокислотным остаткам N-концевого участка нативного ЛФ, обладающих большим, чем ЛФ, микробоцидным действием [10, 12]. ЛФцин содержит большое количество положительно заряженных аминокислотных остатков, расщепляющих ряд поверхностных или секреторных бактериальных белков, участвующих в инфекционном процессе некоторых микробов. Показано, что связывание ЛФцина с бактериальной стенкой приводит к нарушению целостности мембран бактерий и низших грибов. В то же время показано, что антимикробный пептид ЛФцин вне инфекционного процесса в моче отсутствует [3, 10, 13].
Иммунобиохимические лабораторные тесты на лактоферрин и лактоферрицин открывают новые перспективы и для нужд ургентной хирургии и урологии [3, 10, 13]. Например, атипичная картина острого аппендицита с клиникой, симулирующей правостороннюю почечную колику, встречается у каждого пятого больного. Да и в урологии в дополнение к стандартным методам обследования пациентов в условиях приемного отделения, как нами было показано ранее, возможно использование ЛФ не только в качестве дифференциально-диагностического теста, но и как потенциального уросептика [1, 8, 9].
Таким образом, дальнейшие исследования свойств ЛФ и ЛФцина открывают перспективу получения на основе пептидных комплексов ЛФ новых, более эффективных лечебных и профилактических средств.
Цель исследования ‑ сравнить уровни лактоферрина и лактоферрицина в сыворотке крови, моче и фекалиях у больных с ургентной урологической и хирургической патологией.
Материалы и методы исследования. Клиническим материалом для выполнения данного исследования служили три биологические жидкости (кровь, моча, каловая эмульсия), собранные от пациентов контрольной и двух опытных групп. Контрольную группу формировали из волонтерови‑ студентов-медиков и кадровых доноров областной СПК (16 человек), согласившихся в день забора крови предоставить образцы мочи и кала. 30 урологических и 48 хирургических больных, госпитализированных в ГКБ № 3 г. Астрахани в экстренном порядке, составили 2 основные группы. У всех описанных пациентов бригада скорой помощи указала в направительном диагнозе наличие синдрома почечной колики.
Почечная колика была вызвана мочекаменной болезнью (МКБ) у 17 человек, острым пиелонефритом (ОПн) у 10 человек и нефроптозом (Нп) у 3 человек. Всем пациентам при поступлении производилось стандартное клиническое, инструментальное (УЗИ, восходящая урография), лабораторное и биохимическое обследование. В группу хирургических больных, поступивших экстренно с подозрением на острый аппендицит (ОА), вошли пациенты с неуточненным диагнозом, т.е. не подлежащие немедленному оперативному вмешательству в связи с угрозой перитонита. После уточнения хирургического диагноза у этих пациентов и проведения им оперативного лечения катаральный ОА гистологически подтвердился у 17 из 48 хирургических больных, флегмонозный ОА ‑ у остальных 31 человека.
Индивидуальные пробы мочи и сыворотки крови после центрифугирования разливались в микропробирки и хранились до исследования в морозильной камере. Образцы оформленного или жидкого кала разводились изотоническим раствором в 100 раз, как описывалось в предыдущих работах, и вместе с другими биопробами до исследования хранились в микропробирках в морозильной камере. Все образцы сывороток, мочи и фекальной эмульсии тестировали на общую концентрацию белка, уровни лактоферрина (ЛФ) и лактоферрицина (ЛФцин). Уровни ЛФ во всех образцах измерялись одним и тем же набором реагентов на ЛФ (производитель теста ИФА Лактоферрин ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Чувствительность теста на ЛФ составляла примерно 20 нг/мл [10, 14].
Ферментацию лактоферрина в лактоферрицин в индивидуальных пробах сыворотки крови, мочи и фекальной эмульсии пациентов с острым аппендицитом и ургентной урологической патологией производили путем обработки проб пепсином в кислой среде при 37°С в течение 4 ч. После закисления образцов до рН 2,0 0,1 молярным раствором соляной кислоты проводили их гидролиз свиным пепсином с активностью 90 U/мг (Sigma, США). По окончании процесса гидролиза оставшиеся в пробах белки осаждали 10%-ным раствором ТХУ, осадок отделяли центрифугированием, а надосадочную жидкость нейтрализовали до рН 7,2. Концентрацию лактоферрицина в пробах крови, мочи и фекальной эмульсии оценивали спектрофотометрически на волне длиной 280 нм, экстинцию выражали в единицах оптической плотности (е.оп.).
Так как полученные нами результаты не всегда подчинялись законам нормального распределения, мы представили полученные цифровые данные не только в виде средней арифметической и ошибки средней арифметической (верхние части столбцов со значениями), но и в виде медианы (Ме), размаха между крайними значениями или 5-го и 95-го процентилей (Pc05‑Pc95) ‑ нижние строки в каждой ячейки таблиц. Достоверность различий между сравниваемыми группами и при нормальном распределении, и при распределении, не подчиняющемся законам нормального распределения, во всех случаях оценивали по U-критерию Манна‑Уитни. Достоверными считали различия при рU<0,05.
Результаты исследований и их обсуждение. Нами проведено сравнительное изучение особенностей тестов на лактоферрин и лактоферрицин у хирургических и урологических пациентов. Оба теста изучались комплексно одновременно в пробах крови, мочи и фекальной эмульсии. Кроме того, в таблице 1 представлены производные показатели в виде двух отношений: фекального ЛФ (копро-лактоферрина) к сывороточному и копроЛФ к ЛФ мочи (уро-лактоферрину). Весь комплекс исследований выполнен на 78 пациентах с нефролитиазом, нефроптозом, острым пиелонефритом и острым аппендицитом и 16 лицах контрольной группы.
Таблица 1
Изучение уровней ЛФ в крови, моче и фекальной эмульсии у больных с нефролитиазом, нефроптозом, острым пиелонефритом и острым аппендицитом
|
Биопроба |
Результаты определения уровней ЛФ в виде (M±m) и в % к контролю, медиана (Ме) и межквартильный размах между 5-м и 95-м процентилями |
||||
|
|
Доноры n=16 |
МКБ n=17 |
Нп n=3 |
ОПн n=10 |
ОА n=48 |
|
Сыв. крови (нг/мл) |
1040±189 100% 990 (325,5-1355) |
1449±108* 139% 1420 (1170-1720) |
1113±285 107% 1010 (845-1330) |
3363±483* 323% 3360 (2532,5-4680) |
2960±340* 285% 2960 (1365-4115) |
|
Моча (нг/мл) |
28±3,2 100% 32 (24-32) |
162±13,3* 579% 162 (137-212) |
126±40,6* 450% 318 (214-359) |
839±120,7* 2996% 839 (633,3-1168,8) |
29±3,2 104% 32 (10-48) |
|
Фекальная эмульсия (нг/г кала) |
4600±450 100% 4600 (4275-5775) |
3800±420 82,6% 3800 (2600-5100) |
3200±1470 69,6% 3800 (2100-4600) |
4100±690 89,1% 4050 (2825-5550) |
25800±1890* 561% 25800 (16450-28800) |
|
Отношение ЛФфек/ЛФсыв ЛФфек/ЛФмочи (нг/мл×г кала) |
465% 16.430% |
262% 2,350% |
287% 2 540% |
122% 490% |
872% 88,970% |
Примечание: * ‑ различия достоверны (p<0,05) по сравнению с группой контроля
При сравнении уровней ЛФ у 16 волонтеров и доноров и 17 пациентов с нефролитиазом в сыворотках крови установлены статистически достоверные различия (p<0,05). При этом уровень сывороточного ЛФ в крови пациентов с МКБ в 1,4 раза превышал донорские цифры. Уровни сывороточных ЛФ у 3 пациентов с нефроптозом статистически достоверно от донорских не отличались. Наиболее высокие и статистически достоверные значения по сравнению с контрольными (p<0,05) обнаружены в группе из 10 пациентов с острым пиелонефритом. При этом уровни сывороточного ЛФ в крови пациентов с ОПн более чем в 3 раза превышали значения доноров. В объединенной группе из 48 пациентов с острым катаральным или флегмонозным аппендицитом также обнаружены статистически достоверные цифры по сравнению с контрольными (p<0,05). При этом уровень сывороточного ЛФ в крови пациентов с ОА в 2,85 раза превышал донорские цифры (табл. 1).
При сравнении уровней ЛФ в моче у 16 волонтеров и доноров и 17 пациентов с нефролитиазом установлены статистически достоверные различия (p<0,05). При этом уровень уро-ЛФ в крови пациентов с МКБ почти в 6 раз превышал донорские цифры. Сывороточные уровни ЛФ у 3 пациентов с нефроптозом также статистически достоверно превышали значения доноров (p<0,05). При этом уровни уро-ЛФ в крови пациентов с Нп в 4,5 раза превышали донорские цифры. Наиболее высокие и статистически достоверные цифры по сравнению с контрольными (p<0,05) обнаружены в группе из 10 пациентов с острым пиелонефритом. При этом уровни уро-ЛФ в крови пациентов с ОПн почти в 30 (!) раз превышали донорские цифры. В объединенной группе из 48 пациентов с острым катаральным или флегмонозным аппендицитом их уровни статистически достоверно от донорских не отличались (табл. 1).
При сравнении уровней ЛФ в фекальной эмульсии 17 пациентов с нефролитиазом, 3 пациентов с нефроптозом и 10 пациентов с острым пиелонефритом установлено, что их уровни копро-ЛФ статистически достоверно от значений доноров не отличались. Наоборот, повышенное содержание копро-ЛФ в фекалиях (p<0,05) наблюдается у больных с классической картиной острого аппендицита любой степени тяжести (табл. 1).
Результаты определения отношения ЛФфек/ЛФсыв в контрольной группе колеблются вокруг значения в 450‑500% и в 2‑4 раза ниже этого значения у всех пациентов с урологической патологией, в 2 раза выше контрольных цифр при синдроме почечной колики у пациентов с острым флегмонозным аппендицитом (табл. 1). Еще более контрастным выглядит отношение ЛФфек/ЛФмочи, которое в контрольной группе колеблется вокруг значения в 15‑20 тысяч%, и у всех пациентов с урологической патологией в 6,5‑33,5 раза ниже этого значения, и наоборот, более чем 5 раз выше контрольных цифр при синдроме почечной колики у пациентов с острым флегмонозным аппендицитом (табл. 1).
По уровню лактоферрина установлены различия между группами больных, поступивших с острым аппендицитом и острой урологической патологией, сопровождающейся приступом почечной колики. Так, по уровню лактоферрина в моче (уро-лактоферрину) у ургентных урологических больных с СПК по сравнению с больными с ОА все результаты выше, а различия статистически достоверны (р<0,05). Наоборот, повышенное содержание лактоферрина в фекальной эмульсии (копро-лактоферрина) более чем в 5,5 раза наблюдается у больных с клинической картиной острого аппендицита и отсутствует у больных с нефролитиазом, нефроптозом и острым пиелонефритом (различие статистически достоверно при p<0,05). Результаты комплексного изучения уровней ЛФцина в сыворотке крови, моче и фекалиях у пациентов с нефролитиазом, нефроптозом, острым пиелонефритом и острым аппендицитом отражены в таблице 2.
Таблица 2
Изучение уровней ЛФцина в крови, моче и фекальной эмульсии у больных с нефролитиазом, нефроптозом, острым пиелонефритом и острым аппендицитом
|
Биопроба |
Результаты определения уровней ЛФцина в виде (M±m) и в % к контролю, медиана (Ме) и межквартильный размах между 5-м и 95-м процентилями |
||||
|
|
Контроль n=16 |
МКБ n=17 |
Нп n=3 |
ОПн n=10 |
ОА n=48 |
|
Сыв. крови е.оп. |
0,27±0,028 100% 0,279 (0,069-0,476) |
0,39±0,038* 144% 0,429 (0,099-0,686) |
0,24±0,068 89% 0,242 (0,128-0,734) |
0,45±0,057* 167% 0,483 (0,158-0,697) |
0,47±0,028* 174% 0,519 (0,034-0,831) |
|
Моча е.оп. |
0,21±0,023 100% 0,212 (0,070-0,423) |
0,31±0,032* 148% 0,310 (0,101-0,611) |
0,19±0,052 90% 0,163 (0,011-0,284) |
0,35±0,047* 167% 0,355 (0,154-0,629) |
0,37±0,022* 176% 0,375 (0,122-0,745) |
|
Фекальная эмульсия е.оп. |
0,34±0,042 100% 0,369 (0,024-0,603) |
0,50±0,058* 147% 0,589 (0,034-0,869) |
0,30±0,102 88% 0,306 (0,126-0,480) |
0,53±0,093 156% 0,579 (0,052-0,928) |
0,60±0,040* 176% 0,713 (0,034-1,000) |
|
Отношение ЛФцфек/ЛФцсыв ЛФцфек/ЛФцмочи |
126% 162% |
128% 161% |
125% 158% |
118% 151% |
128% 162% |
Примечание: * ‑ различия достоверны (p<0,05) по сравнению с группой контроля
При сравнении уровней лактоферрицина у 16 волонтеров и доноров и 17 пациентов с нефролитиазом в сыворотках крови установлены статистически достоверные различия (p<0,05). При этом уровень сывороточного ЛФцина в крови пациентов с МКБ в 1,44 раза превышал донорские цифры. Сывороточный уровень ЛФцина у 3 пациентов с нефроптозом статистически достоверно от донорских не отличался. Наиболее высокие и статистически достоверные цифры по сравнению с контрольными (p<0,05) обнаружены в группе из 10 пациентов с острым пиелонефритом. При этом уровни сывороточного ЛФцина в крови пациентов с ОПн в 1,67 раза превышали донорские цифры. В объединенной группе из 48 пациентов с острым катаральным или флегмонозным аппендицитом обнаружены самые высокие и статистически достоверные значения по сравнению с контрольными (p<0,05). При этом уровень сывороточного ЛФцина в крови пациентов с ОА более чем в 1,7 раза превышал донорские цифры (табл. 2).
При сравнении уровней ЛФцина в моче у 16 волонтеров и доноров и 17 пациентов с нефролитиазом установлены статистически достоверные различия (p<0,05). При этом уровень уро-ЛФцина в крови пациентов с МКБ почти в 1,5 раза превышал донорские цифры. Уровень уро-ЛФцина у 3 пациентов с нефроптозом статистически достоверно от донорских значений не отличался. Наиболее статистически достоверные значениия по сравнению с контрольными (p<0,05) обнаружены в группе из 10 пациентов с острым пиелонефритом. При этом уровни уро-ЛФ в крови пациентов с ОПн почти в 1,7 раза превышали донорские значения. В объединенной группе из 48 пациентов с острым катаральным или флегмонозным аппендицитом обнаружены самые высокие и статистически достоверные показатели уро-ЛФцина, по сравнению с контрольными (p<0,05), превышавшие донорские значения почти в 1,8 раза (табл. 2).
При сравнении уровней ЛФцина в каловой эмульсии у 16 волонтеров и доноров и 17 пациентов с нефролитиазом установлены статистически достоверные различия (p<0,05). При этом уровень копро-ЛФцина в крови пациентов с МКБ почти в 1,5 раза превышал донорские показатели. Уровень копро-ЛФцина у 3 пациентов с нефроптозом статистически достоверно от донорских значений не отличался. Статистически недостоверные результаты по сравнению с контрольными значениями обнаружены и в группе из 10 пациентов с острым пиелонефритом. И это несмотря на то, что уровни копро-ЛФ в кале пациентов с ОПн более чем в 1,5 раза превышали донорские значения. В объединенной группе из 48 пациентов с острым аппендицитом обнаружены самые высокие и статистически достоверные значения копро-ЛФцина по сравнению с контрольными (p<0,05), превышавшие донорские цифры почти в 1,8 раза (табл. 2).
Результаты определения отношения ЛФцинфек/ЛФцинсыв в контрольной группе и во всех без исключения опытных группах и при МКБ, и при остром пиелонефрите, и при синдроме почечной колики у пациентов с острым аппендицитом, и даже у пациентов с нефроптозом концентрации лактоферрицина в фекальной эмульсии стабильно на 118‑128% выше сывороточных значений (табл. 2). Еще более стабильные значения дает отношение ЛФцинфек/ЛФцинмочи, которое во всех без исключения группах колеблется в узком диапазоне 151‑162% в пользу фекальной эмульсии.
Таким образом, лактоферрин и продукт его гидролиза лактоферрицин в крови, моче и фекальной эмульсии больных с СПК и ОА ведут себя различным образом (табл. 2).
Выводы
Проведено сравнительное изучение особенностей тестов на лактоферрин и лактоферрицин в крови, моче и фекалиях у хирургических и урологических пациентов. Установлено, что при синдроме почечной колики любой этиологии концентрация уро-ЛФ достоверно выше, чем при остром аппендиците. Наоборот, копро-лактоферрин повышен более чем в 5 раз только у больных с клинической картиной ОА, но не у больных с нефролитиазом, нефроптозом, острым пиелонефритом. Обнаруженное явление позволяет проводить дифференциальную диагностику неясной клинической картины почечной колики на фоне ОА или урологической патологии. Установлено, что концентрации лактоферрицина у всех пациентов контрольных и опытных групп в фекальной эмульсии гораздо выше, чем в сыворотке крови или в моче, на одну и ту же постоянную величину. В пределах отдельных групп концентрация лактоферрицина и при хирургической, и при урологической патологии напрямую связана со степенью тяжести воспалительного процесса у пациентов. Таким образом, лактоферрин и продукт его гидролиза лактоферрицин выполняют в организме различные функции.