Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

CALORY RESTRICTION ALTERS THE ACTIVITY OF ANTIOXIDATIVE SYSTEM ENZYMES AT THE MICE WITH MELANOMA B-16

Fefelova Y.A. 1 Sergeeva E.Yu. 1 Titova N.M. 2
1 Krasnoyarsk state medical university named after professor V.F. Voino-Yasenetsky Ministry of Health of Russia
2 Siberian Federal University
The aim of this study was to investigate the influence of calory restriction on the development of experimental tumor melanomaB-16 at mice. In the investigation female С57/BL6 mice divided into four groups – control animals kept a basic diet and calory restrictive diet, the animals with melanoma B-16 kept a basic diet and calory restrictive diet were used. Liver supernatant was used for spectrophotometric assessment of malonic dialdehyde level, the activity of antioxidative enzymes such as superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and glutathione S-transferase. Expression level analysis of sirt1 in tumor tissue was performed by RT-qPCR. Calory restriction of melanoma B-16 mice was not found to activate lipid peroxidation and to alter the activity of superoxide dismutase and catalase. At the same time, glutathione peroxidase activity and glutathione S-transferase were decreased, accordingly, 1,6 and 1,2 times. Under this, sirt1 expression level in tumor cells of calory restrictive mice was increased. This effect was absent at mice kept a basic diet. The findings allow to suppose that calory restriction influences on tumor development by means of alterations of antioxidative enzymes activity and sirt1 expression level.
calory restriction
melanomab-16
sirtuins
oxidative stress
antioxidant enzymes

Одним из приоритетных современных направлений исследований стало изучение семейства белков сиртуинов (SIRTUIN1-7) в связи с их значительной ролью в регуляции клеточного гомеостаза у млекопитающих. SIRT1, один из семейства этих белков, регулирует процессы метаболизма в организме, что в существенной степени определяет его роль в развитии ряда патологий, в том числе различных видов рака [1].

Известно, что роль окислительного стресса в процессе развития злокачественных опухолей неоднозначна. С одной стороны, окислительный стресс способен индуцировать процессы, играющие важную роль в инициации опухолевого роста. Установлено, что повышение продукции активных форм кислорода, в том числе и под действием ультрафиолетового излучения, способствует повышению продукции меланина и меланомогенезу [2]. C другой стороны, при поздних стадиях развития опухоли окислительный стресс способствует гибели опухолевых клеток и предотвращает метастазирование [3].

Существует определенное количество исследований, показывающих положительное влияние ограничения калорийности при злокачественных новообразованиях, в частности меланоме [4].

Тем не менее механизмы опухольсупрессивного эффекта ограничения калорийности до сих пор окончательно не исследованы.

Цель исследования

Изучение влияния низкокалорийной диеты на экспрессию гена sirt1 и активность ферментов антиоксидантной системы в опухолевых клетках и клетках печени у мышей линии С57ВL6 с экспериментальной меланомой В-16.

Материалы и методы исследования

Объект исследования – самки мышей линии С57/BL6 массой 20–22 г. Мышей содержали при постоянной температуре 20–22°C со световым периодом 12 ч в индивидуальных клетках. Диета животных была строго сбалансирована, для чего использовался гранулированный полнорационный комбикорм «Чара» (ГОСТ ISO 9001-2011(ISO 9001:2008).

Список экспериментальных процедур одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (протокол № 57/2014).

Для исследований в качестве контрольных образцов использовали мышей, находящихся на базовой диете (adlibitum), – 1-я группа, и на диете, составляющей 70% от диеты, удовлетворяющей физиологические потребности животных, – 2-я группа. Опытным животным подкожно перевивали 5х105 клеток меланомы B-16 в 0,5 мл раствора Хенкса. После трансплантации опухоли меланомы В-16 мыши случайным образом были разделены на две опытные группы: 3-я группа (7 мышей) получала диету 1-й группы; 4-я группа (8 мышей) получала диету 2-й группы. На 22-е сутки, после эвтаназии животных, опухоль иссекали в пределах непораженных тканей и извлекали печень.

Уровень экспрессии гена sirt1 определяли в опухолевой ткани и оценивали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. Постановку метода осуществляли на приборе StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Сингапур). Очищенную РНК предварительно подвергали обратной транскрипции со случайными гексамерными праймерами. Реакционная смесь для обратной транскрипции содержалa 5 мкл ОТ-буфера, 1 мкл 25 мМ случайных праймеров, 2 мкл 20 мМ дитиотреитола, 1 мкл 25 мМ дНТФ, 5 е.а. фермента MMLV обратной транскриптазы, 4 мкл раствора РНК (около 2 мкг), воду без нуклеаз до конечного объема 25 мкл. 2 мкл полученной комплементарной ДНК добавляли в ПЦР-смесь следующего состава: 10 мкл ПЦР-смеси (Синтол, Москва, Россия), 1 мкл смеси праймеров и зонда, специфичных для участка гена sirt1 мыши, 12 мкл безнуклеазной воды. Реакцию проводили в соответствии с указаниями производителя праймеров. По окончании реакции относительный уровень экспрессии сиртуина 1 рассчитывали по методу ΔΔCt [5]. В качестве внутреннего контроля использовали экспрессию гена бета-актина.

Гомогенат печени использовали для определения содержания малонового диальдегида, активности антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КТ), глутатионпероксидазы (ГПО) и глутатион-S-трансферазы (ГSТ).

Содержание малонового диальдегида (МДА), продукта перекисного окисления липидов, оценивалось по уровню хромогена, образующегося при взаимодействии МДА с 2-тиобарбитуровой кислотой, интенсивность окраски которого регистрировалась при длине волны 532 нм. Уровень МДА рассчитывали, учитывая коэффициент молярной экстинкции образовавшегося хромогена, равный 1,56*105М-1*см-1, и выражали в мкмоль/г белка [6].

В основу метода определения активности СОД положено ингибирование реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии СОД вследствие дисмутации супероксидных анион-радикалов, которые являются продуктом одного из этапов. Об интенсивности аутоокисления адреналина судили по динамическому нарастанию поглощения при длине волны 347 нм, обусловленному накоплением продукта окисления, не описанного ранее в литературе, и опережающему по времени образование адренохрома, имеющего максимум поглощения при 480 нм [7].

Определение активности КТ основано на образовании окрашенного в желтый цвет комплекса не разрушенной в ходе каталазной реакции перекиси водорода с молибдатом аммония. Активность КТ рассчитывали, используя коэффициент экстинкции пероксида водорода, равный 22,2 * 103 мкМ-1 * см-1 при длине волны 400 нм, и выражали в мкмоль/мин * г белка [8].

Активность ГПО оценивали по изменению содержания ГSТ в пробах до и после инкубации с модельным субстратом – гидропероксидом трет-бутила – в ходе цветной реакции с ДТНБК [8]. Активность ГSТ определяли по скорости образования конъюгатов между ГSТ и 1-хлор-2,4-динитробензолом. Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм. Активность фермента рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции глутатион-S-конъюгатов, 9600 М-1см-1 [8].

По результатам исследования была сформирована база данных, на основе которой с помощью программы Statistica 8 осуществлялся статистический анализ при подсчете медианы и интерквартильного разброса (С25–С75 процентили). Проверку гипотезы о статистической значимости различий показателей двух выборок проводили с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что ограничение калорийности питания у животных с экспериментальной меланомой не приводит к достоверному повышению содержания МДА в гомогенате печени. Активность СОД и КТ при низкокалорийной диете достоверно не изменяется. Ограничение калорийности у животных с меланомой вызывает снижение активности ГПО и ГSТ в гомогенате печени в 1,6 и 1,2 раза соответственно (табл. 1).

Таблица 1

Изменение активности показателей антиоксидантной системы и содержания МДА при ограничении калорийности у мышей с экспериментальной меланомой; группа 3 – базовая диета, группа 4 – диета с ограничением калорийности (70% от базовой диеты)

Показатель

Группа 3 n=10 (7)

Группа 4 n=10 (8)

Ме

С25–С75

Ме

С25–С75

МДА мкмоль/г белка

4,20

3,68–4,57

5,91

3,90–7,41

COД у.е/мин/г белка

1305,50

1188,0–1522,0

1544,50

1340,0–1576,0

КТ ммоль/мин/г белка

262,90

260,30–265,70

290,55

287,40–292,50

ГПO мкмоль/мин/г белка

5,63

5,04–7,74

3,52

3,34–4,29

Р<0,01

ГST ммоль/мин/г белка

7,17

6,93–9,8

5,77

5,0–6,85

Р<0,01

Выявлено усиление экспрессии гена sirt1 в группе мышей, находящихся на диете с ограничением калорийности питания после перевивки клеток опухоли – «Опухоль + ОК», по сравнению с контрольной группой мышей без опухоли и с содержанием на рационе с ограничением калорийности – «ОК». При сравнении группы мышей, находящихся на базовой диете после перевивки клеток опухоли – «Опухоль + БД», с группой мышей без опухоли, находящихся на рационе питания без ограничения калорийности – базовая диета (БД), таких изменений экспрессии гена sirt1 не выявляется. Это может указывать на положительное влияние ОК на экспрессию данного гена и способно опосредовать ряд механизмов, направленных на замедление темпов развития опухоли (табл. 2).

Таблица 2

Влияние диеты на изменение экспрессии гена sirt1 у мышей с экспериментальной меланомой.

группы

Обозначение группы

x¯ (среднее)

m (стандартная ошибка среднего)

1

БД

0,00058

0,00004

2

ОК

0,00031

0,00003

3

БД + Опухоль

0,00163

0,00162

4

ОК + Опухоль

0,00097

0,00033

Примечание: ОК – ограничение калорийности; БД – базовая диета. Р1,2=0,00796; Р2,4=0,039

Ферментативная активность SIRT1зависит от уровня NAD+, что во многом определяет его регулирующую роль в клеточном метаболизме. Ограничение калорийности питания можно рассматривать как стрессовый фактор, влияющий на активность белков семейства сиртуинов (и SIRT1 в том числе). Вмешательство в изменение активности SIRT1 с помощью ограничения калорийности питания может быть одним из направлений, влияющих на процессы меланогенеза.

Усиление экспрессии гена sirt1 в тканях опухоли у мышей при ограничении калорийности питания по сравнению с группой мышей, находящейся на базовой диете, в наших экспериментах указывает на положительное влияние ОК на экспрессию данного гена и может опосредовать ряд механизмов, направленных на замедление темпов развития опухоли. Эти механизмы в существенной степени могут быть реализованы через изменение баланса клеточных про- и антиоксидантных систем.

СОД катализирует реакцию дисмутации супероксиданиона с образованием пероксида водорода. КТ обеспечивает удаление пероксида водорода. ГПО катализирует восстановление органических гидроперекисей и Н2О2. Одновременно в результате действия NАDPН-зависимой глутатионредуктазы происходит восстановление глутатиона, ГSТ использует глутатион для коньюгации с гидрофобными соединениями и восстановления органических пероксидов. ГSТ осуществляет обезвреживание различных органических соединений, к числу которых относятся вещества, обладающие канцерогенным действием.

Таким образом, ограничение калорийности не приводит к усилению продукции свободных радикалов и увеличению степени окислительного стресса в клетках печени мышей с экспериментальной меланомой, а способствует повышению антиоксидантной активности клеток печени. Можно предположить, что данные изменения способны оказывать воздействие на развитие клеток меланомы В-16 в целом. Известно, что одной из особенностей метаболизма, присущих опухолевым клеткам, является повышение продукции активных форм кислорода. Возможно, снижение уровня свободных радикалов способно изменять активность ряда сигнальных путей, в том числе МАРК-сигнальных путей (ERK и JNK), и инициировать гибель клеток меланомы путем апоптоза. Кроме того, установлено, что изменение уровня свободных радикалов способно модулировать действие некоторых противоопухолевых препаратов, в частности, влияя на NF-κB сигнальный путь [9].

Однако получены данные, что sirt1 способствует аутофагии, инициированной действием Н2О2 при окислительном стрессе. Предполагают, что в реализации этого эффекта принимают участие III PI3K/беклин 1 и сигнальный путь mTOR [10]. Следовательно, повышение экспрессии sirt1 может способствовать как гибели опухолевых клеток (аутофагия), так и снижению процесса апоптоза (рис.).

Механизм влияния ограничения калорийности на гибель опухолевых клеток

Заключение

Таким образом, эффекты, вызванные снижением калорийности рациона мышей с меланомой, имеют разнонаправленный характер, а их дальнейшее исследование играет важную роль в понимании фундаментальных механизмов процесса канцерогенеза.