Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) – болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) – хроническая воспалительная патология толстого кишечника, в патогенезе которого важная роль отводится развитию аутоиммунного воспаления с наличием выраженной плазматической инфильтрации и преобладанием Th-2 поляризации иммунного ответа в стенке толстого кишечника. Согласно отчетам, представленным на Европейской гастронеделе (2016), мировая распространенность язвенного колита фиксируется на уровне 50–70 случаев на 100 тыс. населения, с ежегодным приростом заболеваемости для ЯК 5–20 случаев в год. В Российской Федерации по данным Комитета по социальной политике Совета Федерации за 2016 г. распространенность ЯК составляет 16,6 случая на 100 тыс. населения с ежегодным приростом до 11,29%.

Предметом широкой дискуссии является этиопатогенетическая роль факторов иммунной системы в формировании аутоиммунного профиля ВЗК, а возникновение ряда тяжелых побочных эффектов в ходе традиционных протоколов лечения диктует необходимость глубокого изучения иммунопатогенетических аспектов патогенеза с применением экспериментальных моделей ВЗК [1].

В то же время известно, что ВЗК формируются на фоне изменений кишечного микробиоценоза как одного из факторов, приводящих к снижению толерантности по отношению к собственным антигенам [2]. Постулировано также наличие повышенной проницаемости кишечного барьера с последующей активацией постэпителиаль­ных иммунных механизмов к нормальным внутрипрос­ветным микробным или пищевым антигенам. Возможен приобретенный срыв иммунной толерантности к нормальным кишечным антигенам микробного или пищевого характера. Особая роль отводится генетически обусловленной аномалии локального иммунного ответа на собственные антигены. Стенка толстого кишечника содержит в своем составе кишечно-ассоциированную лимфоидную ткань, которой отводится особая роль как в реализации реакций иммунного реагирования на чужеродные антигены, так и в реализации механизмов толерантности к собственным антигенным структурам кишечника. Ведущую роль в этом процессе играют паттерн-распознающие рецепторы (PRR), мембранные и эндосомальные Toll-like-рецепторы (TLR), цитоплазматические NOD-like-рецепторы и сенсоры вирусных РНК – RIG-like-рецепторы, посредством которых осуществляется сигнализация с последующим запуском иммунных реакций. Ряд исследователей отмечают при ВЗК наличие дисбаланса различных субпопуляций Т-хелперов типов 1 (Th1), 2 (Th2), клонов аутоиммунной направленности типа 17 (Th17), а также T-регуляторных субпопуляций лимфоцитов (Treg), основными регуляторами дифференцировки которых являются соответственно транскрипционные факторы T-bet, GATA-3, RORγt и Foxp3 [3].

Цель исследования – на примере экспериментальной оксазолоновой модели язвенного колита изучить роль иммунных факторов в патогенезе данного заболевания.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 37 белых крысах линии Wistar массой 200–220 г в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETSIN 123, 18.03.1986 г.), включая приложение А от 15.06.2006 г., с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях, от 22.09.2010 г. [4]. Животные были разделены случайным образом на 2 группы: 1-я группа (n=7) – интактные животные, 2-я группа (n=30) – животные с ЯК. ЯК моделировали двухэтапным введением 3%-ного оксазолона (Sigma-aldrich, USA), верифицировали клиническими и морфологическими методами [5]. На первом этапе модели проводили накожную сенсибилизацию животного нанесением на предварительно выбритую межлопаточную область 150 мкл 3%-ного раствора оксазолона, предварительно растворенного в 100%-ном этиловом спирте. Второй этап заключался в ректальном введении на глубину 7–8 см 3%-ного раствора оксазолона, предварительно растворенного в 50%-ном этиловом спирте. Верификацию ЯК осуществляли с помощью морфологических и клинических методов. Исследование проводили на 2-е, 4-е и 6-е сутки. Определение гематологических показателей крови, популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов проводили с помощью гематологического анализатора ВС-2800Vet (Mindray, Китай) для ветеринарии и проточного цитофлуориметра Navios (BeckmanCoulter, США) с использованием специфических крысиных моноклональных антител (АО «БиоХимМак Диагностика», г. Москва), с фенотипом CD3⁺ и CD45RA⁺, которые являются маркерами наивных преимущественно Т- и в меньшей степени В-лимфоцитов. Определение уровней IL-6, IL-8 и С-реактивного протеина (CRP) проводили с помощью специфических тест-систем для крыс фирмы ELISA Kit (Китай) на автоматическом иммуноферментном анализаторе Personal LAB (Италия). Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием непараметрических критериев (U – Манна–Уитни, WW – Вальда–Вольфовитца, К – Краскела–Уоллиса). Отличия считали статистически значимыми при р≤0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Для верификации используемой нами экспериментальной модели БК применяли методы оценки выраженности клинических симптомов и морфологической картины в очаге повреждения в стенке толстого кишечника. Клинический статус оценивали по модифицированной шкале Disease activity index (DAI), адаптированной для БК у крыс, наиболее часто используемой в экспериментальных исследованиях и включающей 3 параметра: масса тела, консистенция стула и наличие крови в кале [1]. Каждый критерий оценивали по 4-балльной шкале от 0 до 4, затем баллы суммировали, минимальное значение индекса – 0, максимальное – 12. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Индекс активности болезни (DAI) при экспериментальном ЯК (Ме (Q₂₅-Q₇₅))

Примечание: р – показатель значимости различий с группой 1.

При экспериментальном ЯК у животных со 2-х суток наблюдения отмечались увеличение частоты дефекаций, изменение консистенции кала, появление крови в каловых массах, на 4-е и 6-е сутки наблюдения к указанным признакам добавились снижение массы тела и увеличение выраженности симптомов, что нашло отражение в статистически значимом увеличении индекса DAI в указанные сроки эксперимента. Потеря веса, обусловленная преимущественно наличием анорексии и диареей, составила от 7 до 10%, при этом также отмечалось снижение двигательной активности животных. Анорексигенный эффект может быть обусловлен наличием цитокинемии [6]. В наших экспериментах смертность животных в течение 6 суток экспериментального ЯК отсутствовала. В динамике ЯК значение DAI на 6-е сутки достоверно превышало значения на 2-е и 4-е сутки (р<0,05), что отражает максимальное развертывание воспалительных изменений в толстой кишке крыс.

Со стороны показателей красной крови в динамике экспериментального язвенного колита выявлены изменения содержания эритроцитов и гемоглобина, абсолютные значения которых значимо снижались на 4-е и 6-е сутки в сравнении с показателями 1-й и 2-й группы (интактными животными и 2-е сутки эксперимента соответственно), что в совокупности отражает развитие анемии на фоне прогрессирования воспалительных изменений в стенке толстого кишечника. Об этом свидетельствует и снижение показателя гематокрита уже на 2-е сутки эксперимента, при этом средний корпускулярный объем эритроцита и среднее содержание и концентрация гемоглобина в эритроците, а также показатель распределения эритроцита по объему не имели значимых различий во всех группах (табл. 2).

Таблица 2

Динамика гематологических показателей при экспериментальном язвенном колите

(Me (Q25-Q75))

Примечание: *– статистически значимые различия (p<0,05) с группой 1; RBC – эритроциты; HGB – гемоглобин; НСТ – гематокрит; MCV – средний объем эритроцита; МСН – среднее содержание гемоглобина в эритроците; МСНС – средняя концентрация гемоглобина в эритроците; RDW – распределение эритроцитов по объему.

Исследование показателей белой крови (лейкоцитарная формула) показало изменения в виде значимого увеличения общего числа лейкоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, лимфоцитов и моноцитов крови уже на 2-е сутки эксперимента, преимущественно за счет субпопуляций нейтрофилов, что отражает наличие системного острого воспалительного ответа при нарастании изменений в стенке толстого кишечника.

Увеличение популяции лимфоцитов в крови, вероятно, свидетельствует об активном вовлечении в патологический процесс клеток иммунной системы и участии острофазовых реакций (табл. 3).

Таблица 3

Динамика показателей лейкоцитарного ростка при экспериментальном язвенном колите

(Ме (Q25-Q75))

Примечание: * – статистически значимые различия (p<0,05) с группой 1; ПЯН – палочкоядерные нейтрофилы, СЯН – сегментоядерные нейтрофилы, НФ – нейтрофилы, ЭФ – эозинофилы, БФ – базофилы, ЛФ – лимфоциты, МЦ – моноциты.

Более детальное изучение субпопуляционного спектра лимфоцитов показало, что на 2-е, 4-е и 6-е сутки ЯК статистически значимо увеличивается абсолютное содержание общего количества Т-лимфоцитов (CD3⁺) и числа наивных Т-лимфоцитов, а также В-лимфоцитов и в меньшей степени моноцитов, несущих мембранный маркер CD45RA⁺ лимфоцитов, по сравнению с группой интактных животных. При этом на 2-е сутки прирост количества CD3⁺ составил 66%, количества CD45RA⁺ – 21%, на 4-е сутки – 46% и 39%, на 6-е сутки – 56% и 49% соответственно.

Основой гуморальных межклеточных взаимодействий на этапах развития иммунного ответа являются кооперативные события, опосредованные действием эндогенных интермедиатов. В случае развития воспалительного процесса в дистальных отделах толстого кишечника при оксазолон-индуцированной экспериментальной модели язвенного колита особую роль в реализации реакций иммунного реагирования играют провоспалительные цитокины и некоторые острофазовые протеины. В частности, в ряде исследований в изменении иммунного статуса показана роль регуляторных, провоспалительных цитокинов, хемокинов и белков острой фазы (IL-2, IL-6, IL-8, IL-17, TNF-α, CRP) [7]. В ходе воспалительного ответа иммунные клетки получают мощные антигенные сигналы, способные запустить биосинтез цитокинов и параллельную экспрессию генов-рецепторов в иммуноцитах в течение 1 суток [8]. Установленное нами значимое повышение числа CD3⁺ – Т-лимфоцитов, а также пула наивных CD45RA⁺ лимфоцитов уже на 2-е и максимально на 4-е и 6-е сутки на фоне роста уровня хемокина – IL-8, максимально на 2-е сутки эксперимента способствует активной миграции иммуноцитов в очаг воспаления, примированию тканеспецифическими антигенами кишечной стенки для дальнейшей дифференцировки в Th1, Th2 и клональной экспансии аутоиммунных клонов Т-лимфоцитов, имеющих фенотип Th17-лимфоцитов. В таблице 4 представлена динамика уровня провоспалительных цитокинов и острофазового CRP протеина при развитии экспериментального язвенного колита. Как видно из таблицы 4, уровень IL-6, индукторами выработки которого могут выступать тканевые антигены, бактериальные продукты, острофазовые протеины и другие факторы, значимо повышается уже на 2-е сутки эксперимента, что вполне закономерно, поскольку известно, что экспрессия мРНК для IL-6 происходит в пределах 1 часа после активации, а секреция – в течение первых 4–6 часов. На роль мощного индуктора синтеза провоспалительных цитокинов иммуноцитами претендует CRP-протеин, количество которого (табл. 4) многократно возрастает при любом воспалительном ответе, в частности при развитии язвенного колита, как нами показано, уже на 2-е сутки в сравнении с интактными животными, достигая максимума концентрации к 6-м суткам эксперимента.

Таблица 4

Концентрация провоспалительных факторов в сыворотке при экспериментальном язвенном колите (Me(Q25-Q75))

Примечание: * – статистически значимые различия (p<0,05) с группой 1;

CRP – С-реактивный протеин

Биологический смысл появления в крови белков острой фазы, в частности CRP, заключается в повышении резистентности клеточных мембран к окислению, в ограничении выраженности тканевой альтерации, в активации неспецифических эффекторных систем организма. Примечательно, что индукторами синтеза данного протеина могут являться также и провоспалительные цитокины, хемокины, например IL-6, TNF-α, IL-8. А сам CRP в свою очередь способен модулировать функции Т-лимфоцитов, фагоцитов, тромбоцитов в зависимости от актуальной ситуации на этапах воспалительного процесса.

Выводы

1. В динамике ЯК на 6-е сутки эксперимента значение индекса DAI было максимально высоким, что отражает пиковую экспрессию оксазолон-индуцированных воспалительных изменений в толстой кишке крыс.
2. Максимальное снижение на 6-е сутки эксперимента абсолютных показателей эритроцитов и гемоглобина на фоне роста на 2-е сутки общего числа лейкоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, лимфоцитов, моноцитов крови, а также острофазового протеина (CRP) отражает развитие анемии и формирование системного воспалительного ответа при нарастании изменений в стенке толстого кишечника.
3. При экспериментальном оксазолон-индуцированном ЯК на 2-е, 4-е и 6-е сутки ЯК статистически значимо увеличивается абсолютное содержание общего количества Т- лимфоцитов (CD3⁺) и числа наивных Т-лимфоцитов, а также В-лимфоцитов и в меньшей степени моноцитов, несущих мембранный маркер CD45RA⁺ лимфоцитов, по сравнению с группой интактных животных.
4. На 2-е сутки эксперимента в крови показано наличие цитокинемии в виде роста уровня IL-6, IL-8, отражающее активацию Т-лимфоцитов и макрофагов в очаге воспаления.