Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

РОЛЬ ИММУННЫХ ФАКТОРОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЯЗВЕННОГО КОЛИТА

Бойко М.С. 1 Осиков М.В. 1 Давыдова Е.В. 1 Кайгородцева Н.В. 1 Галеева И.Р. 1 Бычковских В.А. 1
1 ФГБОУ ВО Южно-Уральский государственный медицинский университет Минздрава России
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) – болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) – относятся к хронической воспалительной патологии толстого кишечника, в патогенезе которого важная роль отводится развитию аутоиммунного воспаления с наличием выраженной плазматической инфильтрации и преобладанием Th-2 поляризации иммунного ответа в стенке толстого кишечника. Дискутабельной является роль факторов иммунной системы в формировании аутоиммунного профиля язвенного колита. В то же время возникновение ряда тяжелых побочных эффектов лечения диктует необходимость глубокого изучения иммунопатогенетических аспектов патогенеза с применением экспериментальных моделей. На экспериментальной оксазолоновой модели язвенного колита на 6-е сутки эксперимента значение индекса активности болезни (DAI) отражало максимальную экспрессию воспалительных изменений в толстой кишке крыс. Показатели красной и белой крови, уровень С- реактивного протеина отражали формирование системного воспалительного ответа уже на 2-е сутки эксперимента. Увеличение популяции лимфоцитов происходило преимущественно за счет Т- лимфоцитов (CD3+) и числа наивных Т- и В-лимфоцитов (CD45RA+ позитивных). Маркерами активации иммунных клеток на пике воспалительного ответа служили повышенные уровни провоспалительных цитокинов и хемокинов IL-6 и IL-8 в периферической крови крыс.
оксазолон-индуцированный язвенный колит
клетки крови
Т-лимфоциты
цитокины
1. Kopecki Z., Yang G., Treloar S., Mashtoub S., Howarth G.S., Cummins A.G., Cowin A.J. Flightless I exacerbation of inflammatory responses contributes to increased colonic damage in a mouse model of dextran sulphate sodium-induced ulcerative colitis. Scientific Reports. 2019. no. 9. P. 12792. DOI: 10.1038/s41598-019-49129-6.
2. Ситкин С.И., Вахитов Т.Я., Демьянова Е.В. Микробиом, дисбиоз толстой кишки и воспалительные заболевания кишечника: когда функция важнее таксономии // Альманах клинической медицины. 2018. № 46(5). С.396–425. DOI: 10.18786/2072-0505-2018-46-5-396-425.
3. Ungaro R., Mehandru S., Colombel J-F. Ulcerative colitis. The Lancet. 2017. Vol. 389. no. 10080. P. 1756-1770. DOI: 10.1016/S0140-6736(16)32126-2.
4. Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://rm.coe.int/CoERMPublicCommonSearchServices/DisplayDCTMContent?documentId=090000168007a6a8.
5. Осиков М.В., Симонян Е.В., Бакеева А.Е., Бойко М.С., Бивалькевич В.А. Экспериментальное моделирование и перспективные направления коррекции гомеостаза при воспалительных заболеваниях кишечника // Научно-практический журнал «Аспирантский вестник Поволжья». 2018. № 1–2. С. 153–160. DOI: 10.17816/2075-2354.2018.18.153-160.
6. Graf D., Jennifer M., Monka L., Wua W., Hannah R. Red lentil supplementation reduces the severity of dextran sodium sulfateinduced colitis in C57BL/6 male mice. Journal of Functional Foods. 2020. Vol. 64. P. 103625.
7. Li Jie Lai, Jun Shen, Zhi Hua Ran. Natural killer T cells and ulcerative colitis. // Cellular Immunology. Vol. 335. P. 1-5. DOI: 10.1016/j.cellimm.2018.08.010.
8. Гао Ю., Постовалова Е.А., Добрынина М.Т., Макарова О.В. Половые различия субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови, брыжеечных лимфатических узлах и ободочной кишке при экспериментальном хроническом язвенном колите // Иммунология. 2018. № 39(1). С 32-38. DOI: 10.18821/0206-4952-2018-39-1-32-38.

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) – болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) – хроническая воспалительная патология толстого кишечника, в патогенезе которого важная роль отводится развитию аутоиммунного воспаления с наличием выраженной плазматической инфильтрации и преобладанием Th-2 поляризации иммунного ответа в стенке толстого кишечника. Согласно отчетам, представленным на Европейской гастронеделе (2016), мировая распространенность язвенного колита фиксируется на уровне 50–70 случаев на 100 тыс. населения, с ежегодным приростом заболеваемости для ЯК 5–20 случаев в год. В Российской Федерации по данным Комитета по социальной политике Совета Федерации за 2016 г. распространенность ЯК составляет 16,6 случая на 100 тыс. населения с ежегодным приростом до 11,29%.

Предметом широкой дискуссии является этиопатогенетическая роль факторов иммунной системы в формировании аутоиммунного профиля ВЗК, а возникновение ряда тяжелых побочных эффектов в ходе традиционных протоколов лечения диктует необходимость глубокого изучения иммунопатогенетических аспектов патогенеза с применением экспериментальных моделей ВЗК [1].

В то же время известно, что ВЗК формируются на фоне изменений кишечного микробиоценоза как одного из факторов, приводящих к снижению толерантности по отношению к собственным антигенам [2]. Постулировано также наличие повышенной проницаемости кишечного барьера с последующей активацией постэпителиаль­ных иммунных механизмов к нормальным внутрипрос­ветным микробным или пищевым антигенам. Возможен приобретенный срыв иммунной толерантности к нормальным кишечным антигенам микробного или пищевого характера. Особая роль отводится генетически обусловленной аномалии локального иммунного ответа на собственные антигены. Стенка толстого кишечника содержит в своем составе кишечно-ассоциированную лимфоидную ткань, которой отводится особая роль как в реализации реакций иммунного реагирования на чужеродные антигены, так и в реализации механизмов толерантности к собственным антигенным структурам кишечника. Ведущую роль в этом процессе играют паттерн-распознающие рецепторы (PRR), мембранные и эндосомальные Toll-like-рецепторы (TLR), цитоплазматические NOD-like-рецепторы и сенсоры вирусных РНК – RIG-like-рецепторы, посредством которых осуществляется сигнализация с последующим запуском иммунных реакций. Ряд исследователей отмечают при ВЗК наличие дисбаланса различных субпопуляций Т-хелперов типов 1 (Th1), 2 (Th2), клонов аутоиммунной направленности типа 17 (Th17), а также T-регуляторных субпопуляций лимфоцитов (Treg), основными регуляторами дифференцировки которых являются соответственно транскрипционные факторы T-bet, GATA-3, RORγt и Foxp3 [3].

Цель исследования – на примере экспериментальной оксазолоновой модели язвенного колита изучить роль иммунных факторов в патогенезе данного заболевания.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 37 белых крысах линии Wistar массой 200–220 г в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETSIN 123, 18.03.1986 г.), включая приложение А от 15.06.2006 г., с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях, от 22.09.2010 г. [4]. Животные были разделены случайным образом на 2 группы: 1-я группа (n=7) – интактные животные, 2-я группа (n=30) – животные с ЯК. ЯК моделировали двухэтапным введением 3%-ного оксазолона (Sigma-aldrich, USA), верифицировали клиническими и морфологическими методами [5]. На первом этапе модели проводили накожную сенсибилизацию животного нанесением на предварительно выбритую межлопаточную область 150 мкл 3%-ного раствора оксазолона, предварительно растворенного в 100%-ном этиловом спирте. Второй этап заключался в ректальном введении на глубину 7–8 см 3%-ного раствора оксазолона, предварительно растворенного в 50%-ном этиловом спирте. Верификацию ЯК осуществляли с помощью морфологических и клинических методов. Исследование проводили на 2-е, 4-е и 6-е сутки. Определение гематологических показателей крови, популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов проводили с помощью гематологического анализатора ВС-2800Vet (Mindray, Китай) для ветеринарии и проточного цитофлуориметра Navios (BeckmanCoulter, США) с использованием специфических крысиных моноклональных антител (АО «БиоХимМак Диагностика», г. Москва), с фенотипом CD3+ и CD45RA+, которые являются маркерами наивных преимущественно Т- и в меньшей степени В-лимфоцитов. Определение уровней IL-6, IL-8 и С-реактивного протеина (CRP) проводили с помощью специфических тест-систем для крыс фирмы ELISA Kit (Китай) на автоматическом иммуноферментном анализаторе Personal LAB (Италия). Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием непараметрических критериев (U – Манна–Уитни, WW – Вальда–Вольфовитца, К – Краскела–Уоллиса). Отличия считали статистически значимыми при р≤0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Для верификации используемой нами экспериментальной модели БК применяли методы оценки выраженности клинических симптомов и морфологической картины в очаге повреждения в стенке толстого кишечника. Клинический статус оценивали по модифицированной шкале Disease activity index (DAI), адаптированной для БК у крыс, наиболее часто используемой в экспериментальных исследованиях и включающей 3 параметра: масса тела, консистенция стула и наличие крови в кале [1]. Каждый критерий оценивали по 4-балльной шкале от 0 до 4, затем баллы суммировали, минимальное значение индекса – 0, максимальное – 12. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Индекс активности болезни (DAI) при экспериментальном ЯК (Ме (Q25-Q75))

Группы животных

Группа 1

Интактные

(n=7)

Группа 2

БК 2-е сутки

(n=10)

Группа 2

БК 4-е сутки

(n=10)

Группа 2

БК 6-е сутки

(n=10)

Индекс активности болезни (DAI, у.е.)

0

6,5

(3,0–7,0)

р<0,01

9,0

(6,0–10,0)

р<0,01

10,5

(10,0–11,0)

р<0,01

Примечание: р – показатель значимости различий с группой 1.

При экспериментальном ЯК у животных со 2-х суток наблюдения отмечались увеличение частоты дефекаций, изменение консистенции кала, появление крови в каловых массах, на 4-е и 6-е сутки наблюдения к указанным признакам добавились снижение массы тела и увеличение выраженности симптомов, что нашло отражение в статистически значимом увеличении индекса DAI в указанные сроки эксперимента. Потеря веса, обусловленная преимущественно наличием анорексии и диареей, составила от 7 до 10%, при этом также отмечалось снижение двигательной активности животных. Анорексигенный эффект может быть обусловлен наличием цитокинемии [6]. В наших экспериментах смертность животных в течение 6 суток экспериментального ЯК отсутствовала. В динамике ЯК значение DAI на 6-е сутки достоверно превышало значения на 2-е и 4-е сутки (р<0,05), что отражает максимальное развертывание воспалительных изменений в толстой кишке крыс.

Со стороны показателей красной крови в динамике экспериментального язвенного колита выявлены изменения содержания эритроцитов и гемоглобина, абсолютные значения которых значимо снижались на 4-е и 6-е сутки в сравнении с показателями 1-й и 2-й группы (интактными животными и 2-е сутки эксперимента соответственно), что в совокупности отражает развитие анемии на фоне прогрессирования воспалительных изменений в стенке толстого кишечника. Об этом свидетельствует и снижение показателя гематокрита уже на 2-е сутки эксперимента, при этом средний корпускулярный объем эритроцита и среднее содержание и концентрация гемоглобина в эритроците, а также показатель распределения эритроцита по объему не имели значимых различий во всех группах (табл. 2).

Таблица 2

Динамика гематологических показателей при экспериментальном язвенном колите

(Me (Q25-Q75))

Показатели

Группа 1

Интактные

(n=7)

Группа 2

ЯК 2-е сутки

(n=10)

Группа 2

ЯК 4-е сутки

(n=10)

Группа 2

ЯК 6-е сутки

(n=10)

RBC,

1012

9,35 (9,38–9,91)

8,69 (6,17–9,03)

7,50 (6,01–8,45)

*

6,36 (6,01–7,47)

*

HGB,

г/л

157,0 (150,0–160,0

146,0 (137,0–153,0)

143,0 (140,0–150,0) *

140,0 (137,0–148,0) *

HCT,

%

56,4 (53,2–56,2)

46,60 (44,4–47,2) *

42,9 (39,6–44,6) *

41,35 (39,60–44,0) *

MCV,

фл

59,7 (55,0 –60,2)

59,80 (55,1–59,5)

58,50 (55,5–60,0)

58,90 (55,0–60,0)

MCH,

пг

15,6 (15,8–16,8)

15,4 (15,5–16,5)

15,6 (15,4–16,6)

15,45 (15,3–15,2)

MCHC,

г/л

291,0 (280,0–287,0)

290,0 (280,0–283,0)

291,0 (280,0–282,0)

291,0 (280,0–282,0)

RDW,

%

13,0 (12,9–13,3)

12,6 (12,1–13,6)

13,10 (12,7–13,6)

13,10 (12,7–13,3)

Примечание: *– статистически значимые различия (p<0,05) с группой 1; RBC – эритроциты; HGB – гемоглобин; НСТ – гематокрит; MCV – средний объем эритроцита; МСН – среднее содержание гемоглобина в эритроците; МСНС – средняя концентрация гемоглобина в эритроците; RDW – распределение эритроцитов по объему.

Исследование показателей белой крови (лейкоцитарная формула) показало изменения в виде значимого увеличения общего числа лейкоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, лимфоцитов и моноцитов крови уже на 2-е сутки эксперимента, преимущественно за счет субпопуляций нейтрофилов, что отражает наличие системного острого воспалительного ответа при нарастании изменений в стенке толстого кишечника.

Увеличение популяции лимфоцитов в крови, вероятно, свидетельствует об активном вовлечении в патологический процесс клеток иммунной системы и участии острофазовых реакций (табл. 3).

Таблица 3

Динамика показателей лейкоцитарного ростка при экспериментальном язвенном колите

(Ме (Q25-Q75))

Показатели

Группа 1

Интактные

(n=7)

Группа 2

ЯК 2-е сутки

(n=10)

Группа 2

ЯК 4-е сутки

(n=10)

Группа 2

ЯК 6-е сутки

(n=10)

Лейкоциты, • 109

4,40 (4,0–5,4)

10,45 (7,10–12,80) *

6,45 (6,0–11,4) *

8,95 (6,10–14,2) *

ПЯН, • 109

0,04 (0,00–0,54)

0,37 (0,21–0,38) *

0 *

0,12 (0,07–0,14) *

СЯН, • 109

1,36 (1,33–1,56)

5,41 (2,41–6,14) *

2,43 (2,04–4,78) *

1,99 (1,37–5,39) *

НФ, • 109

1,40 (1,33–1,62)

5,87 (2,62–6,52) *

4,43 (2,04–4,78) *

4,16 (2,01–5,39) *

ЭФ, • 109

0,02 (0,00–0,04)

0,00 (0,00–0,04)

0,12 (0,04–0,22) *

0,28 (0,28–0,31) *

БФ, • 109

0

0

0

0,00 (0,00–0,00) *

ЛФ, • 109

2,88 (2,32–3,59)

4,22 (3,15–4,99)

4,57 (3,59–9,23) *

6,11 (3,59–7,52) *

МЦ, • 109

0,24 (0,23–0,32)

0,81 (0,54–1,28) *

0,39 (0,14–0,91)

0,75 (0,42–0,85)

Примечание: * – статистически значимые различия (p<0,05) с группой 1; ПЯН – палочкоядерные нейтрофилы, СЯН – сегментоядерные нейтрофилы, НФ – нейтрофилы, ЭФ – эозинофилы, БФ – базофилы, ЛФ – лимфоциты, МЦ – моноциты.

Более детальное изучение субпопуляционного спектра лимфоцитов показало, что на 2-е, 4-е и 6-е сутки ЯК статистически значимо увеличивается абсолютное содержание общего количества Т-лимфоцитов (CD3+) и числа наивных Т-лимфоцитов, а также В-лимфоцитов и в меньшей степени моноцитов, несущих мембранный маркер CD45RA+ лимфоцитов, по сравнению с группой интактных животных. При этом на 2-е сутки прирост количества CD3+ составил 66%, количества CD45RA+ – 21%, на 4-е сутки – 46% и 39%, на 6-е сутки – 56% и 49% соответственно.

Основой гуморальных межклеточных взаимодействий на этапах развития иммунного ответа являются кооперативные события, опосредованные действием эндогенных интермедиатов. В случае развития воспалительного процесса в дистальных отделах толстого кишечника при оксазолон-индуцированной экспериментальной модели язвенного колита особую роль в реализации реакций иммунного реагирования играют провоспалительные цитокины и некоторые острофазовые протеины. В частности, в ряде исследований в изменении иммунного статуса показана роль регуляторных, провоспалительных цитокинов, хемокинов и белков острой фазы (IL-2, IL-6, IL-8, IL-17, TNF-α, CRP) [7]. В ходе воспалительного ответа иммунные клетки получают мощные антигенные сигналы, способные запустить биосинтез цитокинов и параллельную экспрессию генов-рецепторов в иммуноцитах в течение 1 суток [8]. Установленное нами значимое повышение числа CD3+ – Т-лимфоцитов, а также пула наивных CD45RA+ лимфоцитов уже на 2-е и максимально на 4-е и 6-е сутки на фоне роста уровня хемокина – IL-8, максимально на 2-е сутки эксперимента способствует активной миграции иммуноцитов в очаг воспаления, примированию тканеспецифическими антигенами кишечной стенки для дальнейшей дифференцировки в Th1, Th2 и клональной экспансии аутоиммунных клонов Т-лимфоцитов, имеющих фенотип Th17-лимфоцитов. В таблице 4 представлена динамика уровня провоспалительных цитокинов и острофазового CRP протеина при развитии экспериментального язвенного колита. Как видно из таблицы 4, уровень IL-6, индукторами выработки которого могут выступать тканевые антигены, бактериальные продукты, острофазовые протеины и другие факторы, значимо повышается уже на 2-е сутки эксперимента, что вполне закономерно, поскольку известно, что экспрессия мРНК для IL-6 происходит в пределах 1 часа после активации, а секреция – в течение первых 4–6 часов. На роль мощного индуктора синтеза провоспалительных цитокинов иммуноцитами претендует CRP-протеин, количество которого (табл. 4) многократно возрастает при любом воспалительном ответе, в частности при развитии язвенного колита, как нами показано, уже на 2-е сутки в сравнении с интактными животными, достигая максимума концентрации к 6-м суткам эксперимента.

Таблица 4

Концентрация провоспалительных факторов в сыворотке при экспериментальном язвенном колите (Me(Q25-Q75))

Показатели

Группа 1

Интактные

(n=7)

Группа 2

ЯК 2-е сутки

(n=10)

Группа 2

ЯК 4-е сутки

(n=10)

Группа 2

ЯК 6-е сутки

(n=10)

IL-8, пг/мл

95,71

(88,51–98,12)

243,47

(222,36–291,08) *

234,91

(217,68–233,41) *

245,74

(225,76–296,36) *

IL-6, пг/мл

15,57

(15,65–18,41)

45,11

(44,18–46,03) *

52,55

(50,63–52,47) *

53,47

(49,71–54,31) *

CRP, пг/мл

82,43(85,17–93,63)

155,2(127,89–159,31) *

150,8 (121,43–142,51) *

174,68 (167,32–309,71) *

Примечание: * – статистически значимые различия (p<0,05) с группой 1;

CRP – С-реактивный протеин

Биологический смысл появления в крови белков острой фазы, в частности CRP, заключается в повышении резистентности клеточных мембран к окислению, в ограничении выраженности тканевой альтерации, в активации неспецифических эффекторных систем организма. Примечательно, что индукторами синтеза данного протеина могут являться также и провоспалительные цитокины, хемокины, например IL-6, TNF-α, IL-8. А сам CRP в свою очередь способен модулировать функции Т-лимфоцитов, фагоцитов, тромбоцитов в зависимости от актуальной ситуации на этапах воспалительного процесса.

Выводы

  1. В динамике ЯК на 6-е сутки эксперимента значение индекса DAI было максимально высоким, что отражает пиковую экспрессию оксазолон-индуцированных воспалительных изменений в толстой кишке крыс.
  2. Максимальное снижение на 6-е сутки эксперимента абсолютных показателей эритроцитов и гемоглобина на фоне роста на 2-е сутки общего числа лейкоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, лимфоцитов, моноцитов крови, а также острофазового протеина (CRP) отражает развитие анемии и формирование системного воспалительного ответа при нарастании изменений в стенке толстого кишечника.
  3. При экспериментальном оксазолон-индуцированном ЯК на 2-е, 4-е и 6-е сутки ЯК статистически значимо увеличивается абсолютное содержание общего количества Т- лимфоцитов (CD3+) и числа наивных Т-лимфоцитов, а также В-лимфоцитов и в меньшей степени моноцитов, несущих мембранный маркер CD45RA+ лимфоцитов, по сравнению с группой интактных животных.
  4. На 2-е сутки эксперимента в крови показано наличие цитокинемии в виде роста уровня IL-6, IL-8, отражающее активацию Т-лимфоцитов и макрофагов в очаге воспаления.

Библиографическая ссылка

Бойко М.С., Осиков М.В., Давыдова Е.В., Кайгородцева Н.В., Галеева И.Р., Бычковских В.А. РОЛЬ ИММУННЫХ ФАКТОРОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЯЗВЕННОГО КОЛИТА // Современные проблемы науки и образования. – 2020. – № 2. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=29659 (дата обращения: 18.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074