Ревматоидный артрит (РА) - хроническое воспалительное аутоиммунное заболевание, характеризующееся воспалением синовиальных тканей и необратимым повреждением хряща и кости в синовиальных суставах, на развитие которого влияют как генетические факторы, так и факторы окружающей среды. Заболевание сопровождается хронической болью, функциональной несостоятельностью суставов и инвалидностью пациентов. Распространенность РА составляет около 1% и в два-три раза чаще встречается у женщин, чем у мужчин.
За последние 50 лет концепция роли иммунной системы в патогенезе РА значительно изменилась [1]. Доказано участие нейтрофилов в возникновении и развитии ряда аутоиммунных заболеваний, в том числе и РА. При РА нарушается регуляция активации нейтрофилов, включая выработку цитокинов и активных форм кислорода, экспрессию генов и апоптоз. У больных РА апоптоз нейтрофилов (особенно в суставах) задерживается, и активированные нейтрофилы в синовиальных тканях и синовиальной жидкости высвобождают цитотоксические протеазы, которые повреждают хрящ. Кроме этого, нейтрофилы участвуют в развитии аутоиммунитета при РА через производство нейтрофильных внеклеточных ловушек (NETs) и экстернализацию внутриклеточных неоэпитопов, например цитруллинированных пептидов.
Внеклеточные ловушки нейтрофилов представляют собой трехмерные хроматин-содержащие структуры, выделяющиеся нейтрофилами в ответ на инфекционные или воспалительные агенты в процессе запрограммированной клеточной гибели NETosis [2]. Основными компонентами NETs являются ДНК, гистоны, ферменты и белки гранул (нейтрофильная эластаза, миелопероксидаза, катепсин G, лактоферрин, желатиназа, лизоцим С, кальпротектин, лейкоцитарная протеиназа и другие). С NETs также связаны некоторые белки цитоскелета: актин и тубулин.
Впервые ловушки были описаны в 2004 году V. Brinkmann с соавторами как альтернативный защитный механизм, с помощью которого нейтрофилы захватывают и, возможно, убивают микробы [2]. Последующие исследования подтвердили это предположение. NETs могут принимать различные формы и превышать в 10-15 раз объем высвобождающей их клетки.
Несмотря на многочисленные исследования, посвященные NETs и опубликованные за последние 15 лет, мы все еще мало знаем о механизмах их образования. В настоящее время идентифицированы индукторы образования NETs, включающие физиологические и нефизиологические молекулы, а также микроорганизмы (грамположительные и грамотрицательные бактерии, вирусы, грибы и простейшие). Наиболее мощными нефизиологическими индукторами NETsis in vitro являются форбол-12-миристат-13-ацетат (ФMA), суперактиватор протеинкиназы C, ионофоры кальция (иономицин и А23187). К физиологически значимым индукторам относятся: N-формилметионил-лейцил-фенилаланин, интерлейкин-8, липополисахарид, оксид азота и фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), компоненты системы комплемента, активированные тромбоциты, пероксид водорода, аутоантитела, кристаллы уратов, сигаретный дым [2]. Физиологическая индукция NETosis связана с toll-подобными рецепторами, но она также может быть индуцирована ионофорами, такими как A23187 и нигерицин.
Наиболее подробно изучен ФMA-индуцированный NETosis, при котором идентифицирован ряд молекулярных процессов, приводящих к образованию сети. ФMA связывается с протеинкиназой С, кальций высвобождается из внутриклеточных хранилищ, и активируется путь Raf-MEK-ERK. Затем на фагосомальной мембране собирается мультимерный комплекс НАДФН-оксидазы и генерируются активные формы кислорода. NETosis, для которого необходима активация NADPH-оксидазы и генерация активных форм кислорода, получил название «NOX2-зависимый NETosis». Активные формы кислорода увеличивают проницаемость мембран, приводя к высвобождению нейтрофильной эластазы, а впоследствии и миелопероксидазы из азурофильных гранул в ядро. Нейтрофильная эластаза сначала разрушает гистоны линкера H1, а затем гистоны ядра и приводит к деконденсации хроматина. Последующее связывание миелопероксидазы с хроматином усиливает его деконденсацию, причем независимо от активности энзима. Детали молекулярного механизма транслокации ферментов из гранул в ядро остаются неизвестными на данный момент [3].
Важную роль в NETosis играет также Ca2+-зависимый фермент - пептидиларгининдеиминаза 4 (PAD4), которая способствует превращению положительно заряженных аргининовых остатков гистонов в электрически нейтральный цитруллин [4]. Однако каким образом происходит ее активация, не известно. Rohrbach A.S. с соавторами было высказано предположение, что активация НАДФН-оксидазы также может быть предпосылкой для активации PAD4. НАДФН-оксидаза регулирует генерацию активных форм кислорода и повышение внутриклеточного уровня кальция, который необходим для активации PAD4 [5]. В результате этих событий происходит деконденденсация хроматина, ядра округляются и расширяются, ядерная оболочка распадается на везикулы, гранулы и митохондрии распадаются. Цитоплазма и кариоплазма смешиваются, цитоскелетные структуры сокращаются и, наконец, клеточная мембрана разрывается и высвобождает клеточное содержимое, которое разворачивается во внеклеточном пространстве с образованием сетеподобной структуры.
Таким образом, в деконденсации хроматина в нейтрофильных гранулоцитах важную роль играет гиперцитруллинация гистонов, а образование аутоантител к цитруллинированным антигенам, по современным представлениям, считается ключевым моментом в патогенезе РА. Поскольку основным источником цитруллинированных белков являются NETs, следовательно, они также участвуют в патогенезе заболевания. В свою очередь, антицитруллиновые антитела и воспалительные цитокины (IL-8, IL-17A, TNF-α) стимулируют NETosis. В результате этих событий замыкается порочный круг генерации цитруллинированных аутоантигенов и индукции аутоиммунных реакций при РА [6].
В ревматологической практике в настоящее время в качестве диагностического маркера РА широкое применение получило определение антицитруллиновых антител. Однако данный метод имеет ряд существенных недостатков: чувствительность всех известных типов антицитруллиновых антител не превышает 83%, а уровень антицитруллиновых антител в большей степени коррелирует с ревматоидным фактором и острофазовыми белками, чем с активностью заболевания, что не позволяет использовать антицитруллиновые антитела для оценки эффективности лечения [7].
На данный момент совершенствование диагностики РА главным образом направлено на поиск и валидацию новых биомаркеров, что особенно важно в свете тенденции к персонализации терапии ревматических заболеваний [7]. В связи с этим изучение функциональных особенностей нейтрофильных гранулоцитов остается перспективным направлением в области улучшения диагностики и поиска новых «мишеней» для избирательного терапевтического воздействия.
Цель исследования: изучить интенсивность спонтанного и индуцированного образования внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови у больных РА.
Материал и методы исследования
В исследование включены 25 больных (18 женщин, 7 мужчин) ревматологического отделения ГУЗ «ГКБСМП № 25» и пациенты ФГБНУ «НИИ КиЭР им. А.Б. Зборовского» с верифицированным диагнозом РА при помощи критериев ACR/EULAR 2010 [8]. Средний возраст составил 51,4±4,5 года, средняя продолжительность заболевания - 2,3±0,8 года. На момент включения больных активность РА по DAS28 [8] была не более 2,6 балла. Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду были выявлены у 15 пациентов с РА (60%). В референтную группу вошли 30 (21 женщина, 9 мужчин, средний возраст 38,2 года) практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту.
Выделение нейтрофилов производили из венозной крови с этилендиаминтетрауксусной кислотой одноэтапным центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-амидотризоата с плотностью верхнего и нижнего градиентов 1080 и 1090 кг/м3 соответственно при 700 g и 20±1 °С в течение 15 мин. Для выделения клеток использовали самостоятельно приготовленные градиенты фиколла-амидотризоата, что позволило контролировать наиболее важные параметры градиента: плотность, рН, осмолярность в оптимальном диапазоне значений, и при необходимости подвергать их коррекции, что обеспечивало высокую степень чистоты нейтрофильной фракции, увеличивало жизнеспособность клеток и уменьшало их неспецифическую активацию. Все градиенты имели расчетную осмолярность в пределах 280-320 мосм/л, рН 7,2-7,4. Нейтрофилы собирали с нижней интерфазы. После этого двукратно отмывали клетки от градиента и тромбоцитов в стандартном фосфатно-солевом буферном растворе, центрифугируя их при 1500 об./мин. в течение 20 мин. в силиконированных пробирках. Разбавление суспензии до нужной концентрации выполняли в среде RPMI-1640.
Определение чистоты выделения нейтрофилов проводилось с помощью окрашивания мазка клеточной суспензии по Май-Грюнвальду. Жизнеспособность клеток оценивали путем окрашивания трипановым синим по общепринятому протоколу с последующим подсчётом как абсолютного числа клеток, так и процентного содержания жизнеспособных нейтрофилов. Степень активации нейтрофилов оценивали при помощи стандартного теста с нитросиним тетразолием.
Стимуляция образования внеклеточных ловушек выполнялась при помощи раствора форбол-12-миристат-13-ацетата (AppliChem, Испания) в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе с конечной концентрацией 50 нМ в течение 3 часов при 37 °С. Контроль спонтанного уровня NET выполнялся таким же образом, с заменой форбол-12-миристат-13-ацетата на стерильный фосфатно-солевой буферный раствор.
Интенсивность образования ловушек регистрировали методом флюоресцентной микроскопии с SYBR green с длиной волны возбуждения 485 нм и эмиссией – 535 нм. Ловушками считали четко определяемые внеклеточные сети с двойной флюоресценцией, превосходящие размер интактных клеток. Результат выражали в процентах как относительное количество клеток с ловушками на 100 сосчитанных лейкоцитов при визуализации не менее 200 клеток в образце.
Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета Statictica 10.0. Результаты выражали как среднее арифметическое (95% доверительный интервал (ДИ)). Для качественных показателей доверительный интервал рассчитывали при помощи биномиального метода. Верхние границы ДИ, превышающие 100%, усекали до 100,0%. Для анализа различий качественных показателей применяли критерий Макнемара или точный критерий Фишера. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты комплексной оценки основных параметров нейтрофилов в группе здоровых лиц и у пациентов с РА представлены в таблице.
Основные параметры выделяемых нейтрофильных клеточных фракций
у здоровых лиц и у больных РА
|
Параметры нейтрофилов |
Здоровые |
Больные РА (М (95%ДИ)) |
p |
|
Средний выход выделенных клеток, % |
53,5 (46,4-60,6) |
57,1 (52,2-62,0) |
>0,05 |
|
Средняя чистота клеточных фракций, % |
97,5 (90,3-100,0) |
93,1 (87,0-99,2) |
>0,05 |
|
Средняя доля жизнеспособных клеток, % |
94,9 (90,2-99,6) |
95,4 (90,3-100,0) |
>0,05 |
|
Средняя доля неактивированных клеток, % |
94,2 (91,1-97,3) |
92,3 (83,8-100,0) |
>0,05 |
|
Средняя доля спонтанного образования NET, % |
3,2 (2,0-4,4) |
7,7 (5,9-9,5) |
<0,05 |
|
Средняя доля индуцированного образования NET, % |
11,6 (9,5-13,7) |
24,4 (17,6-31,2) |
<0,05 |
Из данных таблицы видно, что в референтной группе во фракции нейтрофилов наблюдалось менее 3% примесей, в основном за счет эозинофилов и незначительного числа эритроцитов в отдельных образцах.
У больных РА, по сравнению с референтной группой, отмечалось некоторое увеличение выхода нейтрофилов вместе с увеличением доли клеточных примесей (табл.), преимущественно за счет эритроцитов. Данное явление было выражено в большей степени у 3 пациентов с выраженной анемией. По-видимому, такая особенность связана со снижением относительной плотности эритроцитов и, как следствие, с искажением их седиментационных характеристик. Тем не менее чистота нейтрофильной фракции у таких больных оставалась достаточной для выполнения последующих этапов при условии повышения интенсивности центрифугирования до 700 g. Значения жизнеспособности и неспецифической активации нейтрофилов по результатам теста с нитросиним тетразолием не демонстрировали существенных различий между здоровыми лицами и пациентами с РА.
Средняя доля нейтрофилов со спонтанным ловушкообразованием у больных РА была существенно выше по сравнению со здоровыми лицами (табл.). Частота спонтанного ловушкообразования для нейтрофилов больных РА, позитивных по антицитруллиновым антителам, имела некоторую тенденцию к повышению по сравнению с образцами других пациентов. После применения индукторов ловушкообразования доля нейтрофилов, образующих ловушки, существенно увеличивалась, при этом степень увеличения при неактивном РА также была отчетливо выше по сравнению с нормой (p<0,05).
Морфология внеклеточных ловушек при световой и люминесцентной микроскопии нейтрофилов здоровых лиц и больных РА не демонстрировала существенных межиндивидуальных различий в отношении размеров, формы и содержания ДНК.
Полученные нами экспериментальные данные подтверждают усиленное образование внеклеточных ловушек циркулирующими нейтрофилами, выделенными из периферической крови больных РА [6]. За последние 20-30 лет, благодаря использованию новых технологий, наши знания в области функционирования иммунной системы при различных патологиях (в том числе и при РА) претерпели серьезные изменения [9]. Значительно расширилось представление о спектре функциональных возможностей нейтрофильных гранулоцитов и молекулярных механизмах их реализации. В том числе была обнаружена способность нейтрофилов к образованию NETs и доказана их роль в формировании аутоиммунитета при РА.
Заключение
Таким образом, нами изучено образование внеклеточных ловушек нейтрофилов у больных РА и у здоровых лиц, образующих референтную группу. Показано, что у больных РА, в особенности у пациентов с наличием антицитруллиновых антител, выраженность спонтанного и индуцированного образования внеклеточных ловушек существенно повышена. Это дает возможность рассмотрения NETs в качестве потенциального биомаркера РА, а также раскрывает новые перспективы для разработки новых лекарственных препаратов в целях таргетной иммунотерапии.