Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ОБРАЗОВАНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ

Бедина С.А. 1 Трофименко А.С. 1 Мамус М.А. 1 Тихомирова Е.А. 1 Мозговая Е.Э. 1 Спицина С.С. 1 Девятаева Н.М. 2
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной ревматологии им. А.Б. Зборовского»
2 Государственное автономное профессиональное образовательное учреждение «Волгоградский медицинский колледж»
Изучена способность нейтрофилов периферической крови к спонтанному и индуцированному образованию внеклеточных ловушек у больных ревматоидным артритом (РА). В исследование были включены 25 пациентов с верифицированным диагнозом РА в соответствии с критериями ACR / EULAR 2010 и 30 практически здоровых людей. Выделение нейтрофилов проводили одноэтапным центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-амидотризоата с плотностью верхнего и нижнего градиентов 1080 и 1090 кг/м3 соответственно. Качественный состав нейтрофильной фракции оценивали с помощью микроскопии стандартных мазков, степень активации нейтрофилов оценивали при помощи стандартного теста с нитросиним тетразолием. Стимуляция образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (NETs) выполнялась путем инкубации с форбол-12-миристат-13-ацетатом. Интен-сивность образования NETs регистрировали методом флюоресцентной микроскопии с SYBR green. Чистота фракции нейтрофилов при РА составила 93,3%, доля жизнеспособ¬ных клеток превышала 95%. В группе больных РА и у здоровых лиц наблюдалось спонтанное образование NETs. У больных РА выраженность спонтанного и индуцированного образования нейтрофильных внеклеточных ловушек существенно выше по сравнению со здоровыми лицами. Частота спонтанного и индуцированного ловушкообразования для нейтрофилов больных РА, позитивных по АЦА, имела некоторую тенденцию к повышению по сравнению с образцами других пациентов.
нейтрофил
внеклеточные ловушки нейтрофилов
нетоз
ревматоидный артрит
аутоиммунные заболевания
1. Croia C., Bursi R., Sutera D., Petrelli F., Alunno A., Puxeddu I. One year in review 2019: pathogenesis of rheumatoid arthritis. Clin. Exp. Rheumatol. 2019. Vol. 37(3). P.347-357.
2. Brinkmann V. Neutrophil Extracellular Traps in the Second Decade. J. Innate Immun. 2018. Vol. 10. P. 414–421. DOI: 10.1159/000489829.
3. Papayannopoulos V., Metzler K.D., Hakkim A., Zychlinsky A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 2010. Vol. 191. P. 677–91. DOI: 10.1083/jcb.201006052.
4. Koga T., Morotomi-Yano K., Sakugawa T., Saitoh H., Yano K.I. Nanosecond pulsed electric fields induce extracellular release of chromosomal DNA and histone citrullination in neutrophil-differentiated HL-60 cells. SciRep. 2019. Vol. 9(1). P. 8451. DOI: 10.1038/s41598-019-44817-9.
5. Rohrbach A.S., Slade D.J., Thompson P.R., Mowen K.A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 2012. Vol. 3. P. 360. URL: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2012.00360/full (дата обращения 10.02.2020). DOI: 10.3389/fimmu.2012.00360.
6. Khandpur R., Carmona-Rivera C., Vivekanandan-Giri A., Gizinski A., Yalavarthi S., Knight J.S., Friday S., Li S., Patel R.M., Subramanian V., Thompson P., Chen P., Fox D.A., Pennathur S., Kaplan M.J. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci. Transl. Med. 2013. Vol. 5(178). URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3727661/ (дата обращения 10.02.2020). P. 178ra40. DOI: 10.1126/scitranslmed.3005580.
7. Мамус М.А., Тихомирова Е.А., Бедина С.А., Доценко С.С., Трофименко А.С., Мозговая Е.Э. Внеклеточные нейтрофильные ловушки и их возможная роль в образовании антицитруллиновых антител при ревматоидном артрите // Актуальные проблемы современной ревматологии: сб. науч. работ / Под ред. д.м.н., профессора И.А. Зборовской. Волгоград, 2018. Вып. XXXV. С. 202-211. DOI: 10.18411/978-5-907109-24-7-2018-xxxv-202-211.
8. Насонов Е.Л. Российские клинические рекомендации. Ревматология. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2017. 464 с.
9. Долгушин И.И., Мезенцева Е.А., Савочкина А.Ю., Кузнецова Е.К. Нейтрофил как «многофункциональное устройство» иммунной системы // Инфекция и иммунитет. 2019. Т. 9. № 1. С. 9–38. DOI: 10.15789/2220-7619-2019-1-9-38.

Ревматоидный артрит (РА) - хроническое воспалительное аутоиммунное заболевание, характеризующееся воспалением синовиальных тканей и необратимым повреждением хряща и кости в синовиальных суставах, на развитие которого влияют как генетические факторы, так и факторы окружающей среды. Заболевание сопровождается хронической болью, функциональной несостоятельностью суставов и инвалидностью пациентов. Распространенность РА составляет около 1% и в два-три раза чаще встречается у женщин, чем у мужчин.

За последние 50 лет концепция роли иммунной системы в патогенезе РА значительно изменилась [1]. Доказано участие нейтрофилов в возникновении и развитии ряда аутоиммунных заболеваний, в том числе и РА. При РА нарушается регуляция активации нейтрофилов, включая выработку цитокинов и активных форм кислорода, экспрессию генов и апоптоз. У больных РА апоптоз нейтрофилов (особенно в суставах) задерживается, и активированные нейтрофилы в синовиальных тканях и синовиальной жидкости высвобождают цитотоксические протеазы, которые повреждают хрящ. Кроме этого, нейтрофилы участвуют в развитии аутоиммунитета при РА через производство нейтрофильных внеклеточных ловушек (NETs) и экстернализацию внутриклеточных неоэпитопов, например цитруллинированных пептидов.

Внеклеточные ловушки нейтрофилов представляют собой трехмерные хроматин-содержащие структуры, выделяющиеся нейтрофилами в ответ на инфекционные или воспалительные агенты в процессе запрограммированной клеточной гибели NETosis [2]. Основными компонентами NETs являются ДНК, гистоны, ферменты и белки гранул (нейтрофильная эластаза, миелопероксидаза, катепсин G, лактоферрин, желатиназа, лизоцим С, кальпротектин, лейкоцитарная протеиназа и другие). С NETs также связаны некоторые белки цитоскелета: актин и тубулин.

Впервые ловушки были описаны в 2004 году V. Brinkmann с соавторами как альтернативный защитный механизм, с помощью которого нейтрофилы захватывают и, возможно, убивают микробы [2]. Последующие исследования подтвердили это предположение. NETs могут принимать различные формы и превышать в 10-15 раз объем высвобождающей их клетки.

Несмотря на многочисленные исследования, посвященные NETs и опубликованные за последние 15 лет, мы все еще мало знаем о механизмах их образования. В настоящее время идентифицированы индукторы образования NETs, включающие физиологические и нефизиологические молекулы, а также микроорганизмы (грамположительные и грамотрицательные бактерии, вирусы, грибы и простейшие). Наиболее мощными нефизиологическими индукторами NETsis in vitro являются форбол-12-миристат-13-ацетат (ФMA), суперактиватор протеинкиназы C, ионофоры кальция (иономицин и А23187). К физиологически значимым индукторам относятся: N-формилметионил-лейцил-фенилаланин, интерлейкин-8, липополисахарид, оксид азота и фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), компоненты системы комплемента, активированные тромбоциты, пероксид водорода, аутоантитела, кристаллы уратов, сигаретный дым [2]. Физиологическая индукция NETosis связана с toll-подобными рецепторами, но она также может быть индуцирована ионофорами, такими как A23187 и нигерицин.

Наиболее подробно изучен ФMA-индуцированный NETosis, при котором идентифицирован ряд молекулярных процессов, приводящих к образованию сети. ФMA связывается с протеинкиназой С, кальций высвобождается из внутриклеточных хранилищ, и активируется путь Raf-MEK-ERK. Затем на фагосомальной мембране собирается мультимерный комплекс НАДФН-оксидазы и генерируются активные формы кислорода. NETosis, для которого необходима активация NADPH-оксидазы и генерация активных форм кислорода, получил название «NOX2-зависимый NETosis». Активные формы кислорода увеличивают проницаемость мембран, приводя к высвобождению нейтрофильной эластазы, а впоследствии и миелопероксидазы из азурофильных гранул в ядро. Нейтрофильная эластаза сначала разрушает гистоны линкера H1, а затем гистоны ядра и приводит к деконденсации хроматина. Последующее связывание миелопероксидазы с хроматином усиливает его деконденсацию, причем независимо от активности энзима. Детали молекулярного механизма транслокации ферментов из гранул в ядро остаются неизвестными на данный момент [3].

Важную роль в NETosis играет также Ca2+-зависимый фермент - пептидиларгининдеиминаза 4 (PAD4), которая способствует превращению положительно заряженных аргининовых остатков гистонов в электрически нейтральный цитруллин [4]. Однако каким образом происходит ее активация, не известно. Rohrbach A.S. с соавторами было высказано предположение, что активация НАДФН-оксидазы также может быть предпосылкой для активации PAD4. НАДФН-оксидаза регулирует генерацию активных форм кислорода и повышение внутриклеточного уровня кальция, который необходим для активации PAD4 [5]. В результате этих событий происходит деконденденсация хроматина, ядра округляются и расширяются, ядерная оболочка распадается на везикулы, гранулы и митохондрии распадаются. Цитоплазма и кариоплазма смешиваются, цитоскелетные структуры сокращаются и, наконец, клеточная мембрана разрывается и высвобождает клеточное содержимое, которое разворачивается во внеклеточном пространстве с образованием сетеподобной структуры.

Таким образом, в деконденсации хроматина в нейтрофильных гранулоцитах важную роль играет гиперцитруллинация гистонов, а образование аутоантител к цитруллинированным антигенам, по современным представлениям, считается ключевым моментом в патогенезе РА. Поскольку основным источником цитруллинированных белков являются NETs, следовательно, они также участвуют в патогенезе заболевания. В свою очередь, антицитруллиновые антитела и воспалительные цитокины (IL-8, IL-17A, TNF-α) стимулируют NETosis. В результате этих событий замыкается порочный круг генерации цитруллинированных аутоантигенов и индукции аутоиммунных реакций при РА [6].

В ревматологической практике в настоящее время в качестве диагностического маркера РА широкое применение получило определение антицитруллиновых антител. Однако данный метод имеет ряд существенных недостатков: чувствительность всех известных типов антицитруллиновых антител не превышает 83%, а уровень антицитруллиновых антител в большей степени коррелирует с ревматоидным фактором и острофазовыми белками, чем с активностью заболевания, что не позволяет использовать антицитруллиновые антитела для оценки эффективности лечения [7].

На данный момент совершенствование диагностики РА главным образом направлено на поиск и валидацию новых биомаркеров, что особенно важно в свете тенденции к персонализации терапии ревматических заболеваний [7]. В связи с этим изучение функциональных особенностей нейтрофильных гранулоцитов остается перспективным направлением в области улучшения диагностики и поиска новых «мишеней» для избирательного терапевтического воздействия.

Цель исследования: изучить интенсивность спонтанного и индуцированного образования внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови у больных РА.

Материал и методы исследования

В исследование включены 25 больных (18 женщин, 7 мужчин) ревматологического отделения ГУЗ «ГКБСМП № 25» и пациенты ФГБНУ «НИИ КиЭР им. А.Б. Зборовского» с верифицированным диагнозом РА при помощи критериев ACR/EULAR 2010 [8]. Средний возраст составил 51,4±4,5 года, средняя продолжительность заболевания - 2,3±0,8 года. На момент включения больных активность РА по DAS28 [8] была не более 2,6 балла. Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду были выявлены у 15 пациентов с РА (60%). В референтную группу вошли 30 (21 женщина, 9 мужчин, средний возраст 38,2 года) практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту.

Выделение нейтрофилов производили из венозной крови с этилендиаминтетрауксусной кислотой одноэтапным центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-амидотризоата с плотностью верхнего и нижнего градиентов 1080 и 1090 кг/м3 соответственно при 700 g и 20±1 °С в течение 15 мин. Для выделения клеток использовали самостоятельно приготовленные градиенты фиколла-амидотризоата, что позволило контролировать наиболее важные параметры градиента: плотность, рН, осмолярность в оптимальном диапазоне значений, и при необходимости подвергать их коррекции, что обеспечивало высокую степень чистоты нейтрофильной фракции, увеличивало жизнеспособность клеток и уменьшало их неспецифическую активацию. Все градиенты имели расчетную осмолярность в пределах 280-320 мосм/л, рН 7,2-7,4. Нейтрофилы собирали с нижней интерфазы. После этого двукратно отмывали клетки от градиента и тромбоцитов в стандартном фосфатно-солевом буферном растворе, центрифугируя их при 1500 об./мин. в течение 20 мин. в силиконированных пробирках. Разбавление суспензии до нужной концентрации выполняли в среде RPMI-1640.

Определение чистоты выделения нейтрофилов проводилось с помощью окрашивания мазка клеточной суспензии по Май-Грюнвальду. Жизнеспособность клеток оценивали путем окрашивания трипановым синим по общепринятому протоколу с последующим подсчётом как абсолютного числа клеток, так и процентного содержания жизнеспособных нейтрофилов. Степень активации нейтрофилов оценивали при помощи стандартного теста с нитросиним тетразолием.

Стимуляция образования внеклеточных ловушек выполнялась при помощи раствора форбол-12-миристат-13-ацетата (AppliChem, Испания) в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе с конечной концентрацией 50 нМ в течение 3 часов при 37 °С. Контроль спонтанного уровня NET выполнялся таким же образом, с заменой форбол-12-миристат-13-ацетата на стерильный фосфатно-солевой буферный раствор.

Интенсивность образования ловушек регистрировали методом флюоресцентной микроскопии с SYBR green с длиной волны возбуждения 485 нм и эмиссией – 535 нм. Ловушками считали четко определяемые внеклеточные сети с двойной флюоресценцией, превосходящие размер интактных клеток. Результат выражали в процентах как относительное количество клеток с ловушками на 100 сосчитанных лейкоцитов при визуализации не менее 200 клеток в образце.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета Statictica 10.0. Результаты выражали как среднее арифметическое (95% доверительный интервал (ДИ)). Для качественных показателей доверительный интервал рассчитывали при помощи биномиального метода. Верхние границы ДИ, превышающие 100%, усекали до 100,0%. Для анализа различий качественных показателей применяли критерий Макнемара или точный критерий Фишера. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты комплексной оценки основных параметров нейтрофилов в группе здоровых лиц и у пациентов с РА представлены в таблице.

Основные параметры выделяемых нейтрофильных клеточных фракций
у здоровых лиц и у больных РА

Параметры нейтрофилов

Здоровые
(М (95%ДИ))

Больные РА

(М (95%ДИ))

p

Средний выход выделенных клеток, %

53,5 (46,4-60,6)

57,1 (52,2-62,0)

>0,05

Средняя чистота клеточных фракций, %

97,5 (90,3-100,0)

93,1 (87,0-99,2)

>0,05

Средняя доля жизнеспособных клеток, %

94,9 (90,2-99,6)

95,4 (90,3-100,0)

>0,05

Средняя доля неактивированных клеток, %

94,2 (91,1-97,3)

92,3 (83,8-100,0)

>0,05

Средняя доля спонтанного образования NET, %

3,2 (2,0-4,4)

7,7 (5,9-9,5)

<0,05

Средняя доля индуцированного образования NET, %

11,6 (9,5-13,7)

24,4 (17,6-31,2)

<0,05

 

Из данных таблицы видно, что в референтной группе во фракции нейтрофилов наблюдалось менее 3% примесей, в основном за счет эозинофилов и незначительного числа эритроцитов в отдельных образцах.

У больных РА, по сравнению с референтной группой, отмечалось некоторое увеличение выхода нейтрофилов вместе с увеличением доли клеточных примесей (табл.), преимущественно за счет эритроцитов. Данное явление было выражено в большей степени у 3 пациентов с выраженной анемией. По-видимому, такая особенность связана со снижением относительной плотности эритроцитов и, как следствие, с искажением их седиментационных характеристик. Тем не менее чистота нейтрофильной фракции у таких больных оставалась достаточной для выполнения последующих этапов при условии повышения интенсивности центрифугирования до 700 g. Значения жизнеспособности и неспецифической активации нейтрофилов по результатам теста с нитросиним тетразолием не демонстрировали существенных различий между здоровыми лицами и пациентами с РА.

Средняя доля нейтрофилов со спонтанным ловушкообразованием у больных РА была существенно выше по сравнению со здоровыми лицами (табл.). Частота спонтанного ловушкообразования для нейтрофилов больных РА, позитивных по антицитруллиновым антителам, имела некоторую тенденцию к повышению по сравнению с образцами других пациентов. После применения индукторов ловушкообразования доля нейтрофилов, образующих ловушки, существенно увеличивалась, при этом степень увеличения при неактивном РА также была отчетливо выше по сравнению с нормой (p<0,05).

Морфология внеклеточных ловушек при световой и люминесцентной микроскопии нейтрофилов здоровых лиц и больных РА не демонстрировала существенных межиндивидуальных различий в отношении размеров, формы и содержания ДНК.

Полученные нами экспериментальные данные подтверждают усиленное образование внеклеточных ловушек циркулирующими нейтрофилами, выделенными из периферической крови больных РА [6]. За последние 20-30 лет, благодаря использованию новых технологий, наши знания в области функционирования иммунной системы при различных патологиях (в том числе и при РА) претерпели серьезные изменения [9]. Значительно расширилось представление о спектре функциональных возможностей нейтрофильных гранулоцитов и молекулярных механизмах их реализации. В том числе была обнаружена способность нейтрофилов к образованию NETs и доказана их роль в формировании аутоиммунитета при РА.

Заключение

Таким образом, нами изучено образование внеклеточных ловушек нейтрофилов у больных РА и у здоровых лиц, образующих референтную группу. Показано, что у больных РА, в особенности у пациентов с наличием антицитруллиновых антител, выраженность спонтанного и индуцированного образования внеклеточных ловушек существенно повышена. Это дает возможность рассмотрения NETs в качестве потенциального биомаркера РА, а также раскрывает новые перспективы для разработки новых лекарственных препаратов в целях таргетной иммунотерапии. 


Библиографическая ссылка

Бедина С.А., Трофименко А.С., Мамус М.А., Тихомирова Е.А., Мозговая Е.Э., Спицина С.С., Девятаева Н.М. ОБРАЗОВАНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ // Современные проблемы науки и образования. – 2020. – № 2. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=29587 (дата обращения: 17.05.2022).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074