Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,120

APOPTOSIS IN THE ADHESION PROCESS IN THE ABDOMINAL CAVITY: THE EFFECT OF BLOCKING P38 MAPK

Ayushinova N.I. 1 Shurygina I.A. 1 Chepurnykh E.E. 1 Shurygin M.G. 2
1 Federal State Budgetary Scientific Institution «Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology»
2 Pharmasyntez
Apoptosis is one of the main mechanisms of haemostasis maintenance both in physiological and in pathological conditions. Aim of the work: to study the expression of Bcl proteins in reparative process on the example of perytoneum at natural history of the process and at the blocking of p38 MAPK. We stimulated the adhesive process in abdominal cavity of male Wistar rats – control group (N = 40) and group with Seroguard® introduction (N = 40). We assessed the expression of Bcl2 and Bclx in the area of adhesion formation at terms from 2 hours to 30 days using immunohistochemical methods. In control group, the expression of pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins is concurrent during the first hours. In 12, 24 hours the expression of Вcl2 becomes more intensive than the expression of Bclx. To the 14th day the expression of Bclx and Bcl2 is maximum, and to the 30th day the expression Bclx in the area of adhesion formation is high and is significantly different from the expression of Bcl2. In the treatment group, Bcl2 expression in more intensive in 6 hours than Bclx expression, and in 12, 24 hours Bclx expression becomes more intensive. To the 3rd day the intensity of staining of Bclx decreases twice but remains higher than the intensity of Bcl2 staining. On the 14th day staining of Bcl2 and Bclx is minimal and remains the same up to the 30th day. We determine that using Seroguard® in the model of adhesive process causes apoptosis of fibroblast in the reparation area.
adhesion
apoptosis
р38 марк
bcl2
bclx

Апоптоз, один из важнейших механизмов поддержания гомеостаза, осуществляется как в физиологических, так и в патологических условиях. В настоящее время проблеме апоптоза и его влиянию на течение и исход различных патологических процессов уделяется много внимания. Апоптоз характеризуется рядом характерных морфологических изменений в структуре клетки, а также рядом ферментзависимых биохимических процессов. В результате происходит элиминация клеток из организма с минимальным повреждением окружающих тканей. Нарушения в процессе апоптоза могут приводить к накоплению поврежденных клеток. Поэтому понимание путей апоптоза важно для разработки эффективной терапии при многих заболеваниях [1].

Семейство белков Bcl играет важную роль в регуляции апоптоза, и среди них есть как про-, так и антиапоптотические типы [2].

Белки семейства Bcl-2 признаны основными регуляторами митохондриального пути апоптоза. Они контролируют проницаемость наружной мембраны митохондрий. Кроме того, Bcl-2 белки также обнаружены в других внутриклеточных компартментах, таких как эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи, ядро, пероксисомы. На уровне этих органелл белки семейства Bcl-2 не только регулируют проницаемость наружной мембраны митохондрий удаленно, но также участвуют в основных клеточных процессах, включая гомеостаз кальция, контроль клеточного цикла и миграцию клеток. С развитием методов визуализации живых клеток и созданием флуоресцентных рекомбинантных белков стало ясно, что распределение белков Bcl-2 внутри клетки является динамическим процессом, на который глубоко влияют изменения в клеточном микроокружении. Высокодинамичный процесс внутриклеточного распределения белков семейства Bcl-2 является критическим для определения судьбы клетки [3, 4, 5]. Белки Bcl-2 функционируют посредством межбелковых взаимодействий. Воздействие на белки семейства Bcl-2 открывает новые возможности воздействия на патологические процессы [6].

Поскольку семейство белков Bcl2 является ключевым регулятором апоптоза, нарушения его функций способствуют развитию многих заболеваний, включая рак, нейродегенеративные расстройства и аутоиммунные заболевания [7].

Апоптоз также играет решающую роль в репаративных процессах регенерации. В частности, контроль над плотностью клеток в ткани, образующейся в месте заживления раны, опосредуется апоптозом [8-10].

Цель работы: изучить экспрессию белков семейства Bcl в условиях повреждения брюшины при естественном течении процесса и при блокаде р38 МАРК.

Материал и методы исследования

В качестве модели спаечного процесса в брюшной полости использовали самцов крыс линии Вистар [11, 12]. Представителям контрольной группы (N=40) был введен в брюшную полость физиологический раствор (3 мл), представителям опытной группы (N=40) – препарат «Серогард»® того же объема (АО «Фармасинтез», Россия, товарный знак (знак обслуживания) № 529254 «СЕРОГАРД»). Фармакодинамическим эффектом препарата «Серогард»® является пролонгированная блокада активности p38 MAPK (митогенактивируемой протеинкиназы) [13].

Все исследования проведены с соблюдением этических норм. Исследование одобрено комитетом по этике Иркутского научного центра хирургии и травматологии.

Исследования проводили на 8 временных точках в сроки от 2 часов до 30 суток. Проводили иммуногистохимическое окрашивание образцов. В ходе исследования применяли:

– антитела к Bcl2 rabbit polyclonal (Abbiotec Cat. № 250555, Lot 09110202) в рабочем разведении 1:300 (исследование антиапоптоза);

– Bclx rabbit monoclonal (Epitomics, Cat. № 1018-3, Lot E-07-12-01) в рабочем разведении 1:100 (исследование проапоптоза).

Для математической оценки интенсивности апоптоза и антиапоптоза производили подсчет количества окрашенных Bclx и Bcl2 клеток по отношению к неокрашенным. Определяли медиану, 25%-ный и 75%-ный квартили.

Результаты исследования и их обсуждение

Нами произведены подсчет процента окрашенных на Bclx и Bcl2 клеток и сравнение интенсивности окрашивания внутри основной и контрольной групп, а также между ними.

Таблица 1

Окраска на Bcl2 и Bclx клеток внутри основной и контрольной группы

Срок

Основная

Pu

Контроль

Pu

Bcl2, %

Bclx, %

Bcl2, %

Bclx, %

2 часа

1,5 (1–3)

1,5 (0–2)

1,0

10,5 (10–12)

6,0 (5–7)

0,0277

6 часов

15 (10–17)

5 (2–8)

0,0431

3,5 (1–5)

5,0 (2–15)

0,1775

12 часов

3 (3–3)

17,5 (13–21)

0,0277

35 (17–50)

12,5 (10–20)

0,0116

24 часов

26 (22-30)

40 (38–40)

0,0277

46,5 (37–52)

32 (30–38)

0,0464

3 суток

7,5 (3–10)

20 (15–20)

0,0277

47 (40–50)

41 (35–50)

0,2339

7 суток

3,5 (3–5)

2,5 (2–5)

0,8339

2,5 (2–5)

2,5 (2–3)

0,8339

14 суток

2,5 (2–5)

5,5 (5–7)

0,0277

89,5 (87–95)

91 (85–93)

0,8339

30 суток

9 (7–30)

23,5 (21–25)

0,1158

14 (12–15)

56 (42–65)

0,0277

 

Как следует из таблицы 1, в контрольной группе экспрессия проапоптозных и антиапоптозных белков первые часы течет параллельно. К 12, 24 часам экспрессия Вcl2 интенсивнее, чем Bclx. К 14-м суткам экспрессия Bclx и Bcl2 максимальная, а к 30-м суткам экспрессия Bclx в области формирования спайки высокая и значимо отличается от Bcl2 (рис. 1).

Рис. 1. Интенсивность окраски Bclx и Bcl2 клеток контрольной группы

В контрольной группе к 6 часам экспрессия Bcl2 выше, а к 12, 24 часам, наоборот, экспрессия Bclx значительнее, чем Bcl2. К 3-м суткам интенсивность окраски на Bclx уменьшается вдвое, но все же выше, чем Bclx. На 14-е сутки окраска на Bcl2 и Bclx минимальная и сохраняется такой до 30 суток (рис. 2).

Рис. 2. Интенсивность окраски Bclx и Bcl2 клеток в основной группе

Закономерности экспрессии Bcl2 и Bclxl клеток при сравнении между основной и контрольной группами представлены в таблице 2.

Таблица 2

Сравнение интенсивности окраски Bclx и Bcl2 клеток между группами

Срок

Bcl2, %

Pu

Bclx, %

Pu

 

Основная

Контроль

Основная

Контроль

2 часа

1,5 (1–3)

10,5 (10–12)

0,0049

1,5 (0–2)

6,0 (5–7)

0,0187

6 часов

15 (10–17)

3,5 (1–5)

0,0078

5 (2–8)

5,0 (2–15)

0,9262

12 часов

3 (3–3)

35 (17–50)

0,0054

17,5 (13–21)

12,5 (10–20)

0,2547

24 часа

26 (22–30)

46,5 (37–52)

0,0050

40 (38–40)

32 (30–38)

0,0290

3 суток

7,5 (3–10)

47 (40–50)

0,0017

20 (15–20)

41 (35–50)

0,0088

7 суток

2,5 (3–5)

2,5 (2–5)

0,4107

2,5 (2–5)

2,5 (2–3)

0,4901

14 суток

1,5 (0–4)

89,5 (87–95)

0,0049

5,5 (5–7)

91 (85–93)

0,0047

30 суток

9 (7–30)

14 (12–15)

0,4217

23,5 (21–25)

56 (42–65)

0,00173

 

Как следует из таблицы 2, экспрессия Bcl2 увеличивается первые 6 часов в основной группе, в 12–24 часа значимо ниже, чем в контрольной группе, а в 3-и и 14-е сутки значительно ниже, чем в контрольной группе (рис. 3).


Рис. 3. Окраска на Bcl2 в основной и контрольной группах

Экспрессия Bclx значительно увеличивается к 3-м суткам в контрольной группе с максимумом интенсивности к 14-м и 30-м суткам по сравнению с основной группой (рис. 4).

Рис. 4. Окраска на Bclx в основной и контрольной группах

Таким образом, в ходе исследования показано, что при экспериментальном повреждении брюшины запускаются как апоптоз, и антиапоптоз. В ранние сроки после повреждения брюшины превалирует окраска на маркеры антиапоптоза – до 3 суток, позднее на первый план выходят процессы апоптоза. Наиболее явно различия определяются к концу наблюдения – на 30-е сутки. За счет механизмов запуска апоптоза элиминируется большая популяция клеток фибробластического ряда из зоны повреждения брюшины [14, 15]. При этом окраска на выявление маркеров антиапоптоза в ткани имеет двухволновый характер с максимальной выраженностью на 1–3-и сутки и 14-е сутки процесса. Данные сроки совпадают с периодом роста грануляционной ткани (3-е сутки) и процессом ее созревания (14-е сутки). На финальной точке наблюдения (30-е сутки) количество клеток, демонстрирующих экспрессию антиапоптозных белков, резко снижается (рис. 5).

Рис. 5. Процессы апоптоза и антиапоптоза после травматического повреждения брюшины

Выводы

Нами установлено, что применение Серогарда® при экспериментальном спаечном процессе приводит к активации апоптоза фибробластов в зоне репарации. Указанный механизм действия может предопределить снижение спайкообразования в зоне травмы брюшины.