Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF PRIMARY TUMOR AND P53 PROTEIN EXPRESSION AS PROGNOSTIC MARKERS FOR LOCAL RECURRENCE IN PROSTATE CANCER TREATED BY HIGH-INTENSITY FOCUSED ULTRASOUND

Bakarev M.A. 1 Levin V.P. 2 Neymark A.I. 2 Lushnikova E.L. 1
1 1Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology, Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine
2 Altai State Medical University
Morphological characteristics of primary tumor and p53 protein expression were studied in preoperative biopsy specimens and transurethral resection specimens from 31 patients with localized prostate cancer (PC) with or without a local recurrence within 3 years after a high-intensity focused ultrasound (HIFU) session. It was shown that local PC recurrence after HIFU treatment was associated with less differentiated PC (Gleason score 4+3, 8 and 9) and the presence of cribriform structures in the initial samples, as well as with the indicators of a considerable tumor volume – percentage of positive biopsy cores ≥ 40% and volume density of tumor structures in all specimens ≥ 10%. Immunohistochemical detection of p53 protein in PC structures revealed a heterogeneous pattern of expression: in 23% of all cases there was a weak nuclear immunostaining in a small number of tumor cells (< 10%); elevated nuclear p53 expression (weak positive and strong reaction in ≥ 10% of tumor cells) was detected in 40% of cases with local recurrence (OR = 22,6, p < 0,05). Statistically significant association between elevated p53 expression and local PC progression confirms the validity of p53 protein immunohistochemical detection as a marker for an unfavorable prognosis in HIFU-treated localized PC.
prostate cancer
p53 protein expression
high-intensity focused ultrasound
pathomorphology

Рак предстательной железы (РПЖ) занимает одно из ведущих мест в структуре заболеваемости мужского населения злокачественными новообразованиями, лидируя по среднегодовому темпу прироста, особенно в возрастной группе до 60 лет (15,6%). За последние десятилетия достигнуты успехи в совершенствовании технологий его диагностики и лечения, повысилась частота выявления локализованных форм заболевания – до 44,8% среди вновь выявленных больных [1]. В дополнение к радикальной простатэктомии, сопряженной со значительным количеством осложнений, предложены альтернативные малоинвазивные методы лечения, одним из которых является абляция предстательной железы высокоинтенсивным фокусированным ультразвуком (HIFU) [2, 3].

Ключевой проблемой на пути более широкого применения HIFU-терапии в первичном лечении РПЖ является необходимость разработки критериев отбора и более четкой стратификации пациентов по риску прогрессирования заболевания, прежде всего в группе опухолей низкого и промежуточного риска [4]. Наиболее ценную информацию для этого дает патоморфологическое исследование – степень дифференцировки опухоли по шкале Глисона, а также косвенная оценка ее объема по данным мультифокальной биопсии относятся к факторам прогноза I и II категории согласно рекомендациям Коллегии американских патологов [5].

Помимо рутинного гистологического исследования, для характеристики злокачественного потенциала новообразования все чаще используются молекулярно-биологические маркеры, которые отражают аберрантную активность регуляторных путей, ассоциированных с высоким пролиферативным и метастатическим потенциалом [4, 5]. Для включения таких маркеров в перечень рекомендуемых для применения необходима оценка их прогностического значения при различных видах лечения.

Мутация гена опухолевого супрессора р53 (TP53), приводящая к потере его регуляторных и проапоптотических функций, относится к наиболее распространенным молекулярно-генетическим дефектам при опухолях различных локализаций [6]. По некоторым данным, мутация TP53 свидетельствует об агрессивном подтипе РПЖ и может являться независимым прогностическим фактором специфической выживаемости после консервативного лечения и радикальной простатэктомии [7, 8]. Мутантный белок p53 характеризуется увеличенным временем полужизни и накоплением в ядрах клеток, что делает возможным его выявление иммуногистохимическим методом [6]. При этом имеющиеся в литературе данные о значении данного маркера в условиях ультразвуковой абляции предстательной железы (ПЖ) единичны и носят противоречивый характер [9].

Цель исследования – изучить патоморфологические особенности первичной опухоли и экспрессию белка p53 при локализованном РПЖ для уточнения критериев прогноза локального рецидива в условиях воздействия высокоинтенсивным сфокусированным ультразвуком в сочетании с андрогенной депривацией.

Материал и методы исследования

Обследованы 119 пациентов с РПЖ, которым за период 2011–2017 гг. проведено лечение HIFU на аппарате Ablatherm (EDAP TMS S.A., Франция) с предшествующей трансуретральной резекцией ПЖ (ТУРП) на базе урологического отделения ОКБ ст. Барнаул ОАО «РЖД». Показанием для проведения HIFU был морфологически верифицированный локализованный РПЖ (стадия Т2а-сN0M0) у пациентов, имеющих соматические противопоказания для радикальной простатэктомии или отказавшихся от ее выполнения. Период мониторинга результатов лечения составил от 3 месяцев до 3 лет. Контрольные мультифокальные биопсии носили плановый характер (12±3 месяца) либо выполнялись при подозрении на биохимический рецидив. Показаниями к проведению ТУРП в период мониторинга были снижение объема ПЖ перед повторным сеансом HIFU, а также стриктуры простатического отдела уретры.

По результатам патоморфологического анализа контрольного материала все пациенты были разделены на две группы: 1-я группа – 91 пациент (средний возраст 65,8±8,5 лет), у которых за период мониторинга не выявлено признаков местного прогрессирования; 2-я группа – 28 пациентов (средний возраст 67,6±7,9 лет) с местным рецидивом (резидуальным ростом) РПЖ. В 21 случае (75%) рецидив диагностирован в относительно ранние сроки – через 6–18 месяцев после сеанса HIFU.

В 27 (30%) наблюдениях 1-й и 11 (39%) случаях 2-й группы ультразвуковая абляция ПЖ проведена в сочетании с гормональной терапией (ГТ). Использовали флутамид (250 мг х 3 раза в день) в течение 1–3 месяцев перед HIFU и гозерелин (Золадекс) в дозировке 3,6 мг каждые 28 дней или 10,8 мг каждые 3 месяца на протяжении 3–6 месяцев.

Патоморфологическое исследование проведено на материале 162 образцов первичных биопсий, а также ТУРП 31 пациентов (16 пациентов 1-й и 15 пациентов 2-й группы), отобранных случайным методом из общего массива наблюдений. Распределение пациентов по возрасту, клинико-лабораторным показателям и режимам ГТ в исследуемых группах и соответствующих подгруппах общего массива наблюдений достоверно не отличалось.

Для светооптического исследования биоптаты и образцы, полученные при ТУРП, фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, обрабатывали по общепринятой методике и заключали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином в комбинации с реакцией Перлса, по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию. Парафиновые срезы анализировали в универсальном исследовательском микроскопе Leica DM 4000B, для получения микрофотографий использовали цифровую камеру Leica DFC320 и компьютерную программу Leica QWin V3.

При косвенной оценке объема опухоли в каждом наблюдении по данным анализа диагностически значимых биоптатов определяли относительную долю положительных (содержащих опухоль) столбиков, а также измеряли суммарную объемную плотность опухолевых структур (%) во всех биопсийных столбиках. Морфометрический анализ проводили при помощи компьютерной программы Leica QWin V3. При анализе ассоциации данных показателей с рецидивом заболевания проведены их дихотомизация и подбор пороговых уровней (точек отсечения), обеспечивавших наибольшую силу и достоверность полученной связи (≥ 40% для относительной доли позитивных столбиков и ≥ 10% для показателя объемной плотности).

Для оценки взаимосвязи между степенью дифференцировки (суммой баллов по шкале Глисона) и вероятностью местного прогрессирования после сеанса HIFU-терапии все наблюдения были разделены на три группы риска на основании современных данных по прогнозу 5-летней выживаемости при использовании традиционных методов лечения РПЖ [10]: 1) ≤ 3+4 балла (20 случаев); 2) 4+3 балла (7 случаев); 3) 8–9 баллов (4 случая), был также выбран порог отсечения (≤ 3+4 / ≥ 4+3).

Для оценки злокачественного потенциала опухоли проведено иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к белку-онкосупрессору p53 (клон DO7, Monosan). Интенсивность экспрессии p53 оценивали визуально полуколичественным способом (0, 1+, 2+, 3+), затем подсчитывали долю меченых клеток (учитывали только ядерную экспрессию). Окончательный результат определяли по следующим критериям: отрицательная реакция – отсутствие окрашивания или экспрессия p53 менее чем в 10% опухолевых клеток; слабоположительная реакция – 1+-экспрессия в ≥10% или 2+-экспрессия в 10–50%; выраженная реакция – 2+-экспрессия в >50% или 3+-экспрессия в ≥10% клеток [8].

Учет интенсивности окрашивания обусловлен тем, что, по некоторым данным, высокая степень экспрессии в значительной степени коррелирует с наличием мутации, в то время как слабая реакция может быть связана с физиологическим накоплением белка в условиях клеточного стресса или нарушения регуляторных взаимодействий [11]. Порог отсечения 10% часто использовался для определения положительной экспрессии при исследовании РПЖ [8, 12, 13]; меньшая доля позитивных ядер (<10%) сильнее коррелировала с наличием дикого типа гена при анализе карциномы яичников [11].

Статистический анализ результатов проводили с помощью программы STATISTICA версии 12.0 компании StatSoft, Inc (США). Для относительных величин значения представлены в виде процентного соотношения, для непрерывных – в виде медианы (Me) и межквартильного интервала (IR) (25–75-й процентили). С целью сравнения двух независимых групп по количественному признаку использовали U-критерий Манна–Уитни. При анализе таблиц сопряженности применяли точный критерий Фишера и критерий χ?2 Пирсона, рассчитывали отношение шансов (OR) и границы 95%-ного доверительного интервала (95% CI). Коррелятивные взаимоотношения оценивали с помощью критерия Спирмена. Различия в сравниваемых группах считались достоверными при уровне статистической значимости p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

По данным большинства исследований объем опухоли в материале мультифокальной биопсии ПЖ имеет прогностическое значение в оценке вероятности биохимического рецидива, метастазирования и летального исхода при различных методах лечения РПЖ [4]. Простым и наиболее часто используемым методом его косвенной оценки является подсчет относительной доли позитивных биопсийных столбиков. Медианное значение данного показателя у пациентов с рецидивом (66,7%; IR 41,6–90,0%) достоверно превышало соответствующее значение 1-й группы (25,0%; IR 16,7–35,4%; p<0,001).

При анализе распределения пациентов обнаружено, что у большинства (81%) пациентов 1-й группы доля положительных образцов в дооперационном материале не превышала 40% (≤ 4 столбиков при 12-точечной биопсии), в то время как наличие рецидива в 80% случаев было ассоциировано с более высокими значениями данного показателя (OR=17,3; 95% CI 2,9–103,0; p=0,002) (табл. 1).

Таблица 1

Распределение пациентов 1-й и 2-й групп по показателям объема опухоли
и индексу Глисона в образцах перед сеансом HIFU-терапии

Показатели

1-я группа,
абс. (%)

2-я группа,
абс. (%)

OR
(95% CI)

p

Доля позитивных
столбиков, %

< 40

13 (81,3)

3 (20,0)

17,3
(2,9–103,0)

0,002

≥ 40

3 (18,7)

12 (80,0)

Относительная площадь опухолевых структур, %

< 10

12 (75,0)

2 (13,3)

19,5
(3,0–126,5)

0,002

10 – 29

3 (18,8)

8 (53,3)

≥ 30

1 (6,2)

5 (33,3)

Индекс Глисона

≤ 3+4

14 (87,5)

6 (40,0)

10,5
(1,7–63,9)

0,011

4+3

2 (12,5)

5 (33,3)

8-9

0 (0)

4 (26,7)

Примечание: пунктиром обозначен порог отсечения, использованный при дихотомизации признака; OR – отношение шансов, CI – доверительный интервал.

 

Определение суммарной объемной плотности опухолевых структур во всех биопсийных столбиках – более сложный, хотя и более строгий с морфометрической точки зрения способ оценки объема опухолевого поражения. У пациентов с рецидивом медианное значение данного показателя (20,4%; IR 14,2–30,8%) значительно превосходило соответствующее значение 1-й группы (3,5%; IR 2,3–12,2%; p=0,001), при этом в 75% наблюдений без рецидива показатели объемной плотности были ниже порога отсечения (10%). Местное прогрессирование в большинстве случаев (87%) было ассоциировано с более высокими значениями этого параметра (OR=19,5; 95% CI 3,0–126,5; p=0,002), причем в 1/3 наблюдений 2-й группы объем опухоли превышал 30% (табл.).

Установлена положительная корреляционная зависимость между косвенными показателями объема опухоли (относительной долей положительных столбиков и объемной плотностью опухолевых структур в первичных биоптатах) и наличием местного рецидива после сеанса HIFU-терапии (r=0,63 и 0,59 соответственно; p<0,001).

При оценке степени дифференцировки РПЖ на дооперационном этапе в группе без рецидива значительно преобладали наблюдения невысокого риска с суммой Глисона ≤ 3+4 (87,5% случаев), градация 7 (4+3) зарегистрирована только в 2 (12,5%) наблюдениях. Во 2-й группе отмечался существенный сдвиг в сторону менее дифференцированных форм – градации 7 (4+3), 8 и 9 в сумме диагностированы в 60% случаев, а их выявление было достоверно ассоциировано с прогрессированием РПЖ после HIFU-терапии (OR = 10,5; 95% CI 1,7–63,9; p=0,011) (табл.). Зарегистрирована положительная корреляция между группой риска по шкале Глисона и выявлением местного рецидива (r=0,52, p=0,003).

Опухолевые структуры 4-й градации представляют собой разнородную группу паттернов, некоторые из них могут иметь особое прогностическое значение. На сегодняшний день имеются данные, подтверждающие достоверную связь крибриформного паттерна с биохимическим рецидивом и отдаленными метастазами после лучевой терапии и радикальной простатэктомией [14]. В нашем исследовании криброзные комплексы (рис. 1, а), отмеченные в 21% предоперационных образцов 2-й группы в качестве ведущего компонента и еще в 5% – в качестве вторичного, в материале 1-й группы полностью отсутствовали, различия носили достоверный характер (p=0,012).

В единичных случаях в первичных биоптатах пациентов с рецидивом встречались другие гистологические маркеры неблагоприятного прогноза, такие как периневральная инвазия и внутрипротоковая карцинома простаты (7 и 5% образцов 2-й группы соответственно). Последняя имела крибриформную структуру с очагами солидаризации, местами сохраняла контур ветвящихся протоков (рис. 1, б).

б

Рис. 1. Криброзные структуры в биоптате (а) и материале ТУРП (б) пациентов 2-й группы:
а – светлоклеточная аденокарцинома криброзного строения; б – крибриформные структуры в просвете ветвящегося протока (внутрипротоковая карцинома простаты).
Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х200

Анализ биоптатов и материала ТУРП пациентов с РПЖ показал, что основными фоновыми изменениями неопухолевой паренхимы ПЖ были доброкачественная гиперплазия (ДГПЖ) различной степени выраженности, признаки которой наблюдались в 75% доступных образцов ТУРП, а также очаговые атрофические и атрофически-пролиферативные изменения, преобладавшие в периферической зоне простаты и во многих случаях ассоциированные с признаками хронического воспаления. Солокализацию участков простой атрофии и постатрофической гиперплазии с зонами умеренной и выраженной воспалительно-клеточной инфильтрации (наблюдавшуюся в 35% наших наблюдений) в настоящее время принято обозначать термином «пролиферативная воспалительная атрофия». Топографические и молекулярно-генетические параллели с простатической интраэпителиальной неоплазией высокой степени (ПИН) и РПЖ позволяют некоторым авторам рассматривать данные изменения в качестве предопухолевых [15].

При иммуногистохимической оценке экспрессии белка p53 отмечено практически полное отсутствие специфического окрашивания в неопухолевых железах нормального строения и узлах ДГПЖ, в некоторых случаях наблюдалась слабоположительная реакция в единичных рассеянных клетках базального слоя (рис. 2, а). Очаговые скопления слабопозитивных ядер преимущественно базальной локализации (1+-экспрессия в 10 – 30% ядер) нередко встречались в участках пролиферативной воспалительной атрофии (рис. 2, б), а также в очагах ПИН вблизи опухоли. В отдельно расположенных очагах ПИН реакция была менее выражена, но также превосходила базальный уровень (рис. 2, в).

б

Рис. 2. Экспрессия p53 в неопухолевой паренхиме ПЖ в материале ТУРП пациентов 1-й группы: а – единичные p53-позитивные базальные клетки в зоне доброкачественной гиперплазии ПЖ. Ув. х400; б – слабоположительная реакция в клетках базального слоя в зоне пролиферативной воспалительной атрофии (1+, 28% клеток). Ув. х200; в – слабая экспрессия p53 в очаге ПИН (1+, 6% клеток). Ув. х400

Экспрессия р53 в структурах РПЖ отличалась гетерогенностью. В 18 (58%) наблюдениях экспрессия отсутствовала или наблюдалась в единичных ядрах опухолевых клеток (менее 1%). В 7 наблюдениях (23% всех случаев) отмечено слабое по интенсивности окрашивание немногочисленных (до 10%) ядер, что рассматривалось как негативная реакция (рис. 3, а). Достоверных различий по данному признаку между группами не выявлено.

б

Рис. 3. Экспрессия p53 в структурах РПЖ в биоптатах пациентов 1-й (а) и 2-й групп (б, в):
а – единичные позитивные опухолевые клетки в очаге умеренно дифференцированной аденокарциномы; б – слабоположительная реакция в очаге аденокарциномы криброзного строения (2+, 31% клеток); г – выраженная реакция в очаге умеренно дифференцированной аденокарциномы (3+, 73% клеток). Ув. х400

В 6 наблюдениях (19% всех случаев) в дооперационных образцах зафиксирована повышенная экспрессия p53 – умеренное или выраженное по интенсивности окрашивание 22–73% ядер опухолевых клеток (рис. 3, б, в). У всех пациентов с аномальной реакцией через 10–21 месяц после сеанса HIFU-терапии диагностирован рецидив РПЖ (40% наблюдений 2-й группы). Достоверная ассоциация между гиперэкспрессией p53 и местным прогрессированием (OR=22,6; 95% CI 1,1–446,8; p=0,040) подтверждалась данными корреляционного анализа (r=0,53, p<0,001).

Во многих первичных биоптатах с повышенной экспрессией p53 имели место и другие гистологические признаки, которые указывали на низкую степень дифференцировки опухоли и неблагоприятный прогноз (рис. 3, б). Установлена статистически значимая, хотя и довольно слабая корреляция между экспрессией p53 и группой риска по шкале Глисона (r=0,40, p=0,024). Тем не менее тот факт, что в отдельных наблюдениях с рецидивом гиперэкспрессия наблюдалась в клетках умеренно дифференцированной аденокарциномы (рис. 3, г), указывает на то, что в ряде случаев данный маркер может иметь существенное независимое значение для прогноза и выбора тактики лечения.

Экспрессия p53-протеина в очагах прекурсорных изменений (пролиферативной воспалительной атрофии, ПИН высокой степени) указывает на то, что потеря функции данного гена может играть ключевую роль уже на ранних этапах канцерогенеза [15]. И, хотя слабоположительная реакция не обязательно означает наличие мутации [11], в ряде работ на основе сочетания методов лазерной микродиссекции, секвенирования и гибридизации in situ удалось показать повышенный уровень мутаций TP53 и хромосомной нестабильности в очагах ПИН высокой степени у пациентов с РПЖ [12].

Заключение

Существенными факторами, определяющими вероятность сохранения опухолевых клеток после воздействия высокоинтенсивного сфокусированного ультразвука на ткань ПЖ, являются особенности самой опухоли, в первую очередь ее объем и злокачественный потенциал.

По нашим данным, повышение частоты местного прогрессирования при лечении локализованного РПЖ методом HIFU-терапии ассоциировано с преобладанием менее дифференцированных форм аденокарциномы (4+3, 8 и 9 баллов по Глисону), наличием криброзных структур в первичных биоптатах, а также с характеристиками опухоли, указывающими на ее значительный объем, – относительной долей позитивных биопсийных столбиков ≥ 40% (более 4 столбиков при 12-точечной биопсии) и относительной площадью опухолевых структур во всех образцах ≥ 10%. Тот факт, что даже небольшое содержание криброзных элементов может быть ассоциировано с последующим развитием местного рецидива, свидетельствует о целесообразности специального учета криброзного подтипа для выделения пациентов с повышенным риском местного прогрессирования после HIFU-терапии.

Продемонстрированная нами достоверная взаимосвязь между аномальной экспрессией p53-протеина и местным рецидивом подтверждает значимость иммуногистохимической оценки данного маркера как фактора неблагоприятного прогноза при HIFU-терапии локализованного РПЖ.