Бронхиальная астма (БА) – гетерогенное заболевание с большим количеством клинико-патогенетических вариантов, которое развивается при сложном взаимодействии множества генов, факторов внешней среды (триггеров) и ген-средовых взаимодействий [1, 2].
Определяющим условием для успешного лечения бронхиальной астмы становится концепция, объединяющая генетику с патогенезом заболевания, поэтому молекулярно-генетические исследования при БА представляют особый интерес.
Перспективными для изучения при бронхиальной астме являются рецепторы врожденного иммунитета (TLR), реализующие свое действие на начальных этапах иммунного ответа и во многом определяющие интенсивность иммунных реакций на микробные и немикробные аллергены [2].
Установлено, что TLR участвуют в распознавании аллергенов в дыхательных путях, регулируют активность и поляризацию адаптивного Th1, Th2, Th17 – иммунного ответа, играя важную патогенетическую роль в развитии БА [1].
Цель исследования: определение клинико-патогенетического значения полиморфных маркеров рецепторов врожденного иммунитета (TLR) в развитии бронхиальной астмы.
Материал и методы исследования
Иммуногенетические исследования выполнены у 100 человек с бронхиальной астмой русской национальности Юга России, находившихся под наблюдением в ГБУЗ «Городская поликлиника № 1» г. Ставрополя в 2016–2017 гг.
У 65 человек диагностирована аллергическая БА, у 35 – неаллергическая БА. Включенные в исследование больные находились в возрасте от 20 до 75 лет, с медианой возраста в группе АБА – 34 [23,5; 45] года, в группе НБА – 61 [47; 66] год, p<0,001.
В контрольную группу вошли 50 практически здоровых людей русской национальности Южного региона России в возрасте от 18 до 60 лет.
Типирование SNPs TLR2, TLR6, CD14 проводили методом ПДРФ (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP analysis) с предварительной амплификацией интересующего участка и последующим выполнением эндонуклеазой рестрикции. Амплификацию осуществляли с применением многоканального амплификатора «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Россия) с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Для выявления полиморфизмов TLR2, TLR6, CD14 методом полимеразной цепной реакции в геноме человека в работе использовали диагностические тест-системы «SNP-экспресс» ООО НПФ «Литех», г. Москва.
Разделение продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в 3%-ном агарозном геле, приготовленном на ТЕА буфере, с использованием электрофоретической детекции результатов ПЦР («BioRad Laboratories», США).
Для идентификации результатов электрофореза применяли 1%-ный раствор бромистого этидия, фрагменты ДНК визуализировались в виде светящихся оранжево-красных полос (УФ излучение длиной волны 310 нм).
Для статистического анализа данных применяли пакет программ «Statistica SPSS», «Attestat 10.5.1.», «Калькулятор для расчета статистики». Для определения соответствия распределения генотипов в популяции закону Харди–Вайнберга использовали программное обеспечение Hardy-Weinberg equilibrium calculator. Достоверность различий в частотах аллельных вариантов и генотипов определяли посредством критерия χ2 Пирсона, при множественных сравнениях – с помощью критерия χ2 с поправкой Йетса. Для оценки значимости признака вычисляли отношение шансов с определением 95%-ного доверительного интервала.
Результаты исследования и их обсуждение
Полученное в исследовании распределение частот генотипов TLR6 C745Т (χ2=1,02, p>0,05) и CD14 C(-159)T (χ2=1,02, p>0,05) соответствовало равновесному распределению Харди–Вайнберга. Для полиморфизма G2258A (χ2=21,5, p<0,001) установлено отклонение от равновесия Харди–Вайнберга, что было обусловлено различиями между наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностью.
При определении полиморфного варианта rs5743708 TLR2 (2258 G>A) установлено, что у пациентов с БА (84,5%), как и в общей популяции (97%), преобладает мажорный аллель 2258G. Однако он встречается реже, чем в контрольной группе (84,5% и 97%, p<0,05), в отличие от минорного аллеля 2258A (15,5% и 3%, p<0,05), относительный риск развития заболевания у резидентов которого составил 4,4 (95% CI: 1,51–12,8) (табл. 1).
Распространенность генотипа G2258G преобладала в группе условно здоровых людей (97% и 84,5%, p<0,01). Следует отметить, что наличие генотипа G2258G уменьшало риск развития БА (OR=0,24; CI: 0,07–0,85).
Частота гомозиготного генотипа A2258A в 5 раз чаще встречалась при бронхиальной астме, чем в группе здоровых респондентов, однако достоверных отличий получено не было.
В доминантной модели показано увеличение риска развития БА (как для гомозигот, так и для гетерозигот) по предрасполагающему аллелю А, OR=4,17 (95% ДИ: 1,18–14,7) (табл. 2).
Таблица 1
Распределение частот аллелей и генотипов TLR2 у больных бронхиальной астмой
|
Ген |
Аллели /генотип |
Бронхиальная астма (n=100) |
Контрольная группа (n=50) |
χ2 |
OR (95% CI) |
|
2258 G/A TLR2 -753
|
G |
169/200 (84,5%) |
96/100 (97%) |
p=0,004 |
0,23 (0,08-0,66) |
|
A |
31/200 (15,5%) |
4/100 (3%) |
p=0,004 |
4,4 (1,51-12,85) |
|
|
GG |
79/100 (79%) |
47/50 (94%) |
p=0,02 |
0,24 (0,07-0,85) |
|
|
GA |
11/100 (11%) |
2/50 (4%) |
p=0,15 |
2,97 (0,60-13,9) |
|
|
AA |
10/100 (10%) |
1/50 (2%) |
p=0,08 |
5,4 (0,68-43,79) |
p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)
OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал
Таблица 2
Доминантная и рецессивная модели распределения генотипов TLR2 у больных бронхиальной астмой
|
Модель |
Генотипы |
БА (n=100) |
Контрольная группа |
χ2 |
OR (95% CI) |
|
rs5743708 TLR2 2258 G/A Доминантная |
GG |
79/100 (79%) |
47/50 (94%) |
p<0,001 |
4,17 (1,18–14,7) |
|
GA+AA |
21/100 (21%) |
3/50 (6%) |
|||
|
rs5743708 TLR2 2258 G/A Рецессивная |
GA+GG |
90/100 (90%) |
49/50 (98%) |
p=0,150
|
5,44 (0,68–43,8) |
|
АА |
10/100 (10%) |
1/50 (2%) |
p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)
OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал
Таким образом, можно предполагать, что носительство редкого аллеля 2258A повышает риск развития заболевания и обладает предиктивными свойствами в отношении развития бронхиальной астмы, в то время как наличие основного аллеля 2258G и гомозиготного генотипа G2258G уменьшает риск развития БА.
Ранее сообщалось, что иммунный ответ, индуцированный при взаимодействии с TLR2, играет важную роль в развитии Th2-ассоциированых заболеваний и может участвовать в развитии экспериментальной бронхиальной астмы [1-3].
Установлено, что активация TLR2 его синтетическими лигандами APC Pam3Cys способствует увеличению синтеза Th2-ассоциированных молекул IL13 и IL1β, GM-CSF и уменьшению продукции цитокинов, опосредованных Th1 (IL12, IFNα, IL18, IL27) [3].
Существует мнение, что TLR2, присутствующий на поверхности альвеолярных макрофагов, участвует в распознавании аллергенов клещей домашней пыли [2] с формированием Th2 ответа и развитием аллергического воспаления.
Полученные нами результаты согласуются с данными Hussein Y.M, et al., 2012 г., Tizaoui K. et al., 2015 г., свидетельствующими об увеличении числа пациентов с генотипом TLR2_2258GA и TLR2_2258AА в группах детей и взрослых с бронхиальной астмой [4].
При изучении полиморфных маркеров гена TL6 С745Т (rs5743810) у пациентов с бронхиальной астмой чаще, чем в контрольной группе, выявлялся распространенный аллель 745С (46% и 30%, p<0,05), реже – минорный 745T (54% и 70%). Относительный риск развития заболевания у резидентов мажорного аллеля составил 1,99 (95% CI:1, 19–3,31) (табл. 3).
При анализе генотипов отмечалось достоверное уменьшение по сравнению со здоровыми индивидуумами гомозиготного генотипа по минорному аллелю Т745Т (27% и 52%, p<0,05) с уменьшением вероятности развития БА у его обладателей в кодоминатной модели (OR=0,34; 95% CI: 0,17–0,69) (табл. 4).
Низкий риск развития БА у гомозигот, обладающих редким аллелем 745Т, подтвержден в рецессивной модели (табл. 4).
Таблица 3
Распределение частот аллелей и генотипов TLR6 у больных бронхиальной астмой
|
Ген |
Аллели /генотип |
БА (n=100) |
Контрольная группа (n=50) |
χ2 |
OR (95% CI) |
|
TLR6
С745Т |
C |
92/200 (46%) |
30/100 (30%) |
p=0,049 |
1,99 (1,19–3,31) |
|
T |
108/200 (54%) |
70/100 (70%) |
p=0,008 |
0,50 (0,30–0,84) |
|
|
CC |
20/100 (20%) |
6/50 (12%) |
p=0,205 |
1,83 (0,69–4,90) |
|
|
CT |
53/100 (53%) |
18/50 (36%) |
p=0,053 |
2,01 (0,98–4,03) |
|
|
TT |
27/100 (27%) |
26/50 (52%) |
p=0,003 |
0,34 (0,17–0,69) |
p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)
OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал
Таблица 4
Доминантная и рецессивная модели распределения генотипов TLR6
у больных бронхиальной астмой
|
Модель |
Генотипы |
БА (n=100) |
Контрольная группа |
χ2 |
OR (95% CI) |
|
rs5743810 TLR6 745 С/Т Доминантная |
CC |
20/100 (20%) |
6/50 (12%) |
p=0,43 |
0,55 (0,20–1,46) |
|
CT+TT |
80/100 (80%) |
44/50 (88%) |
|||
|
rs5743810 TLR6 745 С/Т Рецессивная |
CT+CC |
73/100 (73%) |
24/50 (48%) |
p<0,005
|
0,34 (0,17–0,69) |
|
TT |
27/100 (27%) |
26/50 (52%) |
p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)
OR-отношение шансов, CI - 95% доверительный интервал
Таким образом, можно предполагать, что носительство полиморфного маркера TLR6 745С является генетическим фактором риска развития бронхиальной астмы, в то время как наличие гомозиготного генотипа по минорному аллелю 745T уменьшает риск развития БА и обладает протективными свойствами.
Клинические исследования, проведенные в последнее десятилетие, показали, что одиночные нуклеотидные полиморфизмы TLR6 играют определенную роль в защите от астмы [5].
Кроме того, было установлено, что лимфоидные клетки у носителей защитного варианта TLR6 демонстрируют повышенную экспрессию цитокинов Th1 и снижение Th2-ассоциированной продукции IL4 после специфической стимуляции [6].
В настоящем исследовании установлено, что аллель TLR6 – 745С обладает предиктивными свойствами и способствует развитию БА, что может быть связано с низкой продукцией IFɤ и высокой IL10 респондентами 745С.
Клеточный механизм, объясняющий ассоциацию полиморфизма TLR6 с уменьшенной продукцией IFɤ Тh1, не известен.
Существует предположение, что доминирующий вариант аллеля 745С TLR6 обусловливает снижение числа функциональных карманов в LRR участке рецептора и нарушает его взаимодействие с лигандами, а также активацию фактора транскрипции NF-kB, в то время как редкий аллель 745Т TLR6 увеличивает их число и ассоциируется с высокой продукцией провоспалительных цитокинов [6].
Высокий уровень IL12 поддерживает поляризацию Th1, что обусловливает недостаточную функцию Th2.
Анализ полиморфного варианта CD14 rs2569190 С(-159)Т не выявил статистически значимых различий распространенности мажорного (59,5% и 55%) и минорного (40,5% и 45%) аллелей у пациентов с бронхиальной астмой по сравнению с контрольной группой.
Не было установлено различий показателей встречаемости гетерозиготного С(-159)Т и гомозиготных С(-159)С, Т(-159)Т генотипов по сравнению со здоровыми респондентами. Риск развития заболевания для гомозигот и гетерозигот или только для гомозигот не увеличивался в доминантной и рецессивной моделях (табл. 5).
В серии исследований, проведенных ранее, не подтверждено, что полиморфные варианты С159Т связаны с развитием бронхиальной астмы [7-9], в других – показано, что ген CD14 можно рассматривать в качестве гена-кандидата, увеличивающего восприимчивость к атопической бронхиальной астме [10, 11].
Таблица 5
Распределение частот аллелей и генотипов CD14 у больных бронхиальной астмой
|
Ген |
Аллели /генотип |
БА (n=100) |
Контрольная группа (n=50) |
χ2 |
OR (95% CI) |
|
CD 14 С(-159)T |
C |
119/200 (59,5%) |
55/100 (55%) |
p=0,46 |
1,20 (0,74–1,95) |
|
T |
81/200 (40,5%) |
45/100 (45%) |
p=0,46 |
0,83 (0,51–1,35) |
|
|
CC |
37/100 (37%) |
14/50 (28%) |
p=0,36 |
1,51 (0,77–3,16) |
|
|
CT |
43/100 (43%) |
27/50 (54%) |
p=0,27 |
1,76 (0,97–3,21) |
|
|
TT |
20/100 (20%) |
9/50 (18%) |
p=0,94 |
1,14 (0,48–2,72) |
p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)
OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал
Таблица 6
Доминантная и рецессивная модели распределения генотипов CD14 у больных бронхиальной астмой
|
Модель |
Генотипы |
БА (n=100) |
Контрольная группа |
χ2 |
OR (95% CI) |
|
rs2569190 CD14 С(-159)Т Доминантная |
CC |
37/100 (37%) |
14/50 (28%) |
p=0,36 |
0,66 (0,32–1,39) |
|
CT+TT |
63/100 (63%) |
36/50 (72%) |
|||
|
rs2569190 CD14 С(-159)Т Рецессивная |
CT+CC |
80/100 (80%) |
41/50 (82%) |
P=0,94
|
1,14 (0,48–2,72) |
|
TT |
20/100 (20%) |
9/50 (18%) |
p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)
OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал
Установлено, что присутствие аллеля С в качестве полиморфного маркера CD14 ассоциировано с увеличением уровня общего IgE [11]. Вероятно, требуются дополнительные исследования по изучению генного полиморфизма CD14 в зависимости от фенотипа БА.
Выводы
- Полиморфизмы генов врожденного иммунитета TLR2 G2258A (rs5743708), TLR6 C745T (rs5743810) ассоциированы с развитием бронхиальной астмы у русских пациентов Юга России. Не установлено ассоциации полиморфных маркеров гена CD14 C(-159)T с развитием бронхиальной астмы.
- Молекулярно-генетическими маркерами повышенного риска развития бронхиальной астмы являются аллели TLR2 2258A, TLR6 745С. Протективными свойствами обладают генотипические варианты TLR2 G2258G и TLR6 C745С и аллель TLR2 2258G.