Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ПОЛИМОРФНЫЕ МАРКЕРЫ ГЕНОВ РЕЦЕПТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА У ВЗРОСЛЫХ ПАЦИЕНТОВ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

Шушанова Л.В. 1 Барычева Л.Ю. 1 Минасян М.М. 1 Душина Л.В. 2
1 ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства Здравоохранения Российской Федерации
2 АНМО «Ставропольский краевой клинический консультативно-диагностический центр»
Большое практическое значение в современной медицине представляет определение биологических предикторов заболевания, которые могут использоваться для оценки риска его развития и реализации клинико-патогенетических фенотипов. Установлено, что TLR участвуют в распознавании аллергенов в дыхательных путях, регулируют активность и поляризацию адаптивного Th1, Th2, Th17 – иммунного ответа, играя важную патогенетическую роль в развитии бронхиальной астмы (БА). Цель исследования: определение клинико-патогенетического значения полиморфных маркеров рецепторов врожденного иммунитета в развитии бронхиальной астмы. В исследование включены 100 взрослых больных с бронхиальной астмой, в том числе 65 – с аллергической бронхиальной астмой, 35 – с неаллергической бронхиальной астмой. Установлено, что полиморфизмы генов рецепторов врожденного иммунитета TLR2 G2258A (rs5743708), TLR6 C745T (rs5743810) ассоциированы с развитием бронхиальной астмы у пациентов русской национальности Юга России. Не установлено ассоциации полиморфных маркеров CD14 C (-159)T (rs2569190) с развитием бронхиальной астмы. Показано, что молекулярно-генетическими маркерами повышенного риска развития бронхиальной астмы являются аллели TLR2 2258A, TLR6 745С. Протективными свойствами обладают генотипические варианты TLR2 G2258G и TLR6 C745С и аллель TLR2 2258G.
бронхиальная астма
полиморфные маркеры генов
рецепторы врожденного иммунитета
1. Гималова Г.Ф., Карунас А.С., Кондрахова А.И., Гизатуллина Э.Н., Сальманова И.А., Кувайцев А.С., Хуснутдинова Э.К. Ген-генные взаимодействия в развитии аллергических заболеваний // Биотехнология от науки к практике. 2014. T.2. С. 19-24.
2. Свитич О.А., Агеева И.В., Ганковская Л.В., Зверев В.В. Терапевтический потенциал лигандов TOLL-подобных рецепторов в иммунотерапии бронхиальной астмы // Аллергология и иммунология. 2017. Т.18. №2. С.80-90.
3. Redecke V., Hаcker H., Datta S.K., Fermin A., Pitha P.M., Broide D.H., Raz E. Cutting edge: activation of Toll-like receptor 2 induces a Th2 immune response and promotes experimental asthma. J. Immunol. 2004. Vol. 172. №5. P. 2739-2743.
4. Hussein Y.M., Awad H.A., Shalaby S.M., Ali A.S., Alzahrani S.S. Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4 polymorphisms and susceptibility to asthma and allergic rhinitis: a case-control analysis. Cell. Immunol. 2012. Vol. 274. №1-2. 34-822402138. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.goV /pubmecl/22402138.1.
5. Puthothu B., Heinzmann A. Is toll-like receptor 6 or toll-like receptor 10 involved in asthma genetics--or both? Allergy. 2006. Vol. 61. №5. P. 649–650.
6. Kormann M.S., Depner M., Hartl D., Klopp N., Illig T., Adamski J., Vogelberg C., Stephan K. Weiland, Erika von Mutius, Kabesch M.. Toll-like receptor heterodimer variants protect from childhood asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2008. Vol. 122. P.86–92.
7. Soo-Jong Hong, Hyo-Bin Kim, Mi-Jin Kang, So-Yeon Lee, Ja-Hyung Kim, Bong-Seong Kim, Seong-Ok Jang, Hyung-Doo Shin, Choon-Sik Park TNF-б (?308 g/a) and CD14 (?159T/C) polymorphisms in the bronchial responsiveness of Korean children with asthma. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2007. Vol. 119. No. 2. P. 398-404.
8. Zhao L. Association of CD14-260 (-159) C>T and asthma: a systematic review and meta-analysis. BMC medical genetics. 2011. Vol. 12. Р.93.
9. Бисюк Ю.А., Белоглазов В.А., Дубовой А.И. С159Т полиморфизм гена рецептора CD14 у взрослых больных бронхиальной астмой в популяции Крыма // Таврический медико-биологический вестник. 2013. Т.16. №3. С.27-30.
10. Zaborowski T., Wojas-Krawczyk K., Krawczyk P., Jankowska O., Siwiec J., Kucharczyk T., Grzybek M., Milanowski J. The effect of CD14 and TLR4gene polymorphisms on the occurrence of atopic andnon-atopic asthma. Adv. Clin. Exp. Med. 2011. Vol. 20. №4. P. 413-421.
11. .Şahinr F., Yıldız P., Kuskucu A., Kuskucu M.A., Karaca N., Midilli K. The effect of CD14 and TLR4 gene polimorphisms on asthma phenotypes in adult Turkish asthma patients: a genetic study. BMC Pulmonary Medicine. 2014. Vol. 14. №20. DOI: 10.1186/1471-2466-14-20.

Бронхиальная астма (БА) – гетерогенное заболевание с большим количеством клинико-патогенетических вариантов, которое развивается при сложном взаимодействии множества генов, факторов внешней среды (триггеров) и ген-средовых взаимодействий [1, 2].

Определяющим условием для успешного лечения бронхиальной астмы становится концепция, объединяющая генетику с патогенезом заболевания, поэтому молекулярно-генетические исследования при БА представляют особый интерес.

 Перспективными для изучения при бронхиальной астме являются рецепторы врожденного иммунитета (TLR), реализующие свое действие на начальных этапах иммунного ответа и во многом определяющие интенсивность иммунных реакций на микробные и немикробные аллергены [2].  

Установлено, что TLR участвуют в распознавании аллергенов в дыхательных путях, регулируют активность и поляризацию адаптивного Th1, Th2, Th17 – иммунного ответа, играя важную патогенетическую роль в развитии БА [1].

Цель исследования: определение клинико-патогенетического значения полиморфных маркеров рецепторов врожденного иммунитета (TLR) в развитии бронхиальной астмы.

Материал и методы исследования

Иммуногенетические исследования выполнены у 100 человек с бронхиальной астмой русской национальности Юга России, находившихся под наблюдением в ГБУЗ «Городская поликлиника № 1» г. Ставрополя в 2016–2017 гг.

У 65 человек диагностирована аллергическая БА, у 35 – неаллергическая БА. Включенные в исследование больные находились в возрасте от 20 до 75 лет, с медианой возраста в группе АБА – 34 [23,5; 45] года, в группе НБА – 61 [47; 66] год, p<0,001.

В контрольную группу вошли 50 практически здоровых людей русской национальности Южного региона России в возрасте от 18 до 60 лет.

Типирование SNPs TLR2, TLR6, CD14 проводили методом ПДРФ (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP analysis) с предварительной амплификацией интересующего участка и последующим выполнением эндонуклеазой рестрикции. Амплификацию осуществляли с применением многоканального амплификатора «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Россия) с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Для выявления полиморфизмов TLR2, TLR6, CD14 методом полимеразной цепной реакции в геноме человека в работе использовали диагностические тест-системы «SNP-экспресс» ООО НПФ «Литех», г. Москва.

Разделение продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в 3%-ном агарозном геле, приготовленном на ТЕА буфере, с использованием электрофоретической детекции результатов ПЦР («BioRad Laboratories», США).

Для идентификации результатов электрофореза применяли 1%-ный раствор бромистого этидия, фрагменты ДНК визуализировались в виде светящихся оранжево-красных полос (УФ излучение длиной волны 310 нм).

Для статистического анализа данных применяли пакет программ «Statistica SPSS», «Attestat 10.5.1.», «Калькулятор для расчета статистики». Для определения соответствия распределения генотипов в популяции закону Харди–Вайнберга использовали программное обеспечение Hardy-Weinberg equilibrium calculator. Достоверность различий в частотах аллельных вариантов и генотипов определяли посредством критерия χ2 Пирсона, при множественных сравнениях – с помощью критерия χ2 с поправкой Йетса. Для оценки значимости признака вычисляли отношение шансов с определением 95%-ного доверительного интервала.

Результаты исследования и их обсуждение

Полученное в исследовании распределение частот генотипов TLR6 C745Т2=1,02, p>0,05) и CD14 C(-159)T2=1,02, p>0,05) соответствовало равновесному распределению Харди–Вайнберга. Для полиморфизма G2258A2=21,5, p<0,001) установлено отклонение от равновесия Харди–Вайнберга, что было обусловлено различиями между наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностью.

При определении полиморфного варианта rs5743708 TLR2 (2258 G>A) установлено, что у пациентов с БА (84,5%), как и в общей популяции (97%), преобладает мажорный аллель 2258G. Однако он встречается реже, чем в контрольной группе (84,5% и 97%, p<0,05), в отличие от минорного аллеля 2258A (15,5% и 3%, p<0,05), относительный риск развития заболевания у резидентов которого составил 4,4 (95% CI: 1,51–12,8) (табл. 1).        

Распространенность генотипа G2258G преобладала в группе условно здоровых людей (97% и 84,5%, p<0,01). Следует отметить, что наличие генотипа G2258G уменьшало риск развития БА (OR=0,24; CI: 0,07–0,85).

Частота гомозиготного генотипа A2258A в 5 раз чаще встречалась при бронхиальной астме, чем в группе здоровых респондентов, однако достоверных отличий получено не было.

В доминантной модели показано увеличение риска развития БА (как для гомозигот, так и для гетерозигот) по предрасполагающему аллелю А, OR=4,17 (95% ДИ: 1,18–14,7) (табл. 2).

Таблица 1

Распределение частот аллелей и генотипов TLR2 у больных бронхиальной астмой

Ген

Аллели

/генотип

Бронхиальная

астма (n=100)

Контрольная

группа (n=50)

χ2

OR (95% CI)

 

2258 G/A

TLR2

-753

 

G

169/200 (84,5%)

96/100 (97%)

p=0,004

0,23 (0,08-0,66)

A

31/200 (15,5%)

4/100 (3%)

p=0,004

4,4 (1,51-12,85)

GG

79/100 (79%)

47/50 (94%)

p=0,02

0,24 (0,07-0,85)

GA

11/100 (11%)

2/50 (4%)

p=0,15

2,97 (0,60-13,9)

AA

10/100 (10%)

1/50 (2%)

p=0,08

5,4 (0,68-43,79)

p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)

OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал

Таблица 2

Доминантная и рецессивная модели распределения генотипов TLR2 у больных бронхиальной астмой

Модель

Генотипы

БА

(n=100)

Контрольная

группа

χ2

OR (95% CI)

rs5743708 TLR2

2258 G/A

Доминантная

GG

79/100 (79%)

47/50 (94%)

p<0,001

4,17 (1,18–14,7)

GA+AA

21/100 (21%)

3/50 (6%)

rs5743708 TLR2

2258 G/A

Рецессивная

GA+GG

90/100 (90%)

49/50 (98%)

p=0,150

 

5,44 (0,68–43,8)

АА

10/100 (10%)

1/50 (2%)

p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)

OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал

Таким образом, можно предполагать, что носительство редкого аллеля 2258A повышает риск развития заболевания и обладает предиктивными свойствами в отношении развития бронхиальной астмы, в то время как наличие основного аллеля 2258G и гомозиготного генотипа G2258G уменьшает риск развития БА.  

Ранее сообщалось, что иммунный ответ, индуцированный при взаимодействии с TLR2, играет важную роль в развитии Th2-ассоциированых заболеваний и может участвовать в развитии экспериментальной бронхиальной астмы [1-3].

Установлено, что активация TLR2 его синтетическими лигандами APC Pam3Cys способствует увеличению синтеза Th2-ассоциированных молекул IL13 и IL1β, GM-CSF и уменьшению продукции цитокинов, опосредованных Th1 (IL12, IFNα, IL18, IL27) [3].

Существует мнение, что TLR2, присутствующий на поверхности альвеолярных макрофагов, участвует в распознавании аллергенов клещей домашней пыли [2] с формированием Th2 ответа и развитием аллергического воспаления.

Полученные нами результаты согласуются с данными Hussein Y.M, et al., 2012 г., Tizaoui K. et al., 2015 г., свидетельствующими об увеличении числа пациентов с генотипом TLR2_2258GA и TLR2_2258AА в группах детей и взрослых с бронхиальной астмой [4].  

При изучении полиморфных маркеров гена TL6 С745Т (rs5743810) у пациентов с бронхиальной астмой чаще, чем в контрольной группе, выявлялся распространенный аллель 745С (46% и 30%, p<0,05), реже – минорный 745T (54% и 70%). Относительный риск развития заболевания у резидентов мажорного аллеля составил 1,99 (95% CI:1, 19–3,31) (табл. 3).

При анализе генотипов отмечалось достоверное уменьшение по сравнению со здоровыми индивидуумами гомозиготного генотипа по минорному аллелю Т745Т (27% и 52%, p<0,05) с уменьшением вероятности развития БА у его обладателей в кодоминатной модели (OR=0,34; 95% CI: 0,17–0,69) (табл. 4).

Низкий риск развития БА у гомозигот, обладающих редким аллелем 745Т, подтвержден в рецессивной модели (табл. 4).  

Таблица 3

Распределение частот аллелей и генотипов TLR6 у больных бронхиальной астмой

Ген

Аллели

/генотип

БА

(n=100)

Контрольная группа (n=50)

χ2

OR (95% CI)

TLR6

 

С745Т

C

92/200 (46%)

30/100 (30%)

p=0,049

1,99 (1,193,31)

T

108/200 (54%)

70/100 (70%)

p=0,008

0,50 (0,30–0,84)

CC

20/100 (20%)

6/50 (12%)

p=0,205

1,83 (0,69–4,90)

CT

53/100 (53%)

18/50 (36%)

p=0,053

2,01 (0,98–4,03)

TT

27/100 (27%)

26/50 (52%)

p=0,003

0,34 (0,17–0,69)

p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)

OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал

Таблица 4

Доминантная и рецессивная модели распределения генотипов TLR6
у больных бронхиальной астмой

Модель

Генотипы

БА

(n=100)

Контрольная

группа

χ2

OR (95% CI)

rs5743810 TLR6

745 С/Т

Доминантная

CC

20/100 (20%)

6/50 (12%)

p=0,43

0,55 (0,20–1,46)

CT+TT

80/100 (80%)

44/50 (88%)

rs5743810 TLR6

745 С/Т

Рецессивная

CT+CC

73/100 (73%)

24/50 (48%)

p<0,005

 

0,34 (0,17–0,69)

TT

27/100 (27%)

26/50 (52%)

p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)

OR-отношение шансов, CI - 95% доверительный интервал

Таким образом, можно предполагать, что носительство полиморфного маркера TLR6 745С является генетическим фактором риска развития бронхиальной астмы, в то время как наличие гомозиготного генотипа по минорному аллелю 745T уменьшает риск развития БА и обладает протективными свойствами.  

Клинические исследования, проведенные в последнее десятилетие, показали, что одиночные нуклеотидные полиморфизмы TLR6 играют определенную роль в защите от астмы [5].

Кроме того, было установлено, что лимфоидные клетки у носителей защитного варианта TLR6 демонстрируют повышенную экспрессию цитокинов Th1 и снижение Th2-ассоциированной продукции IL4 после специфической стимуляции [6].

В настоящем исследовании установлено, что аллель TLR6 745С обладает предиктивными свойствами и способствует развитию БА, что может быть связано с низкой продукцией IFɤ и высокой IL10 респондентами 745С.

Клеточный механизм, объясняющий ассоциацию полиморфизма TLR6 с уменьшенной продукцией IFɤ Тh1, не известен.

Существует предположение, что доминирующий вариант аллеля 745С TLR6 обусловливает снижение числа функциональных карманов в LRR участке рецептора и нарушает его взаимодействие с лигандами, а также активацию фактора транскрипции NF-kB, в то время как редкий аллель 745Т TLR6 увеличивает их число и ассоциируется с высокой продукцией провоспалительных цитокинов [6].

Высокий уровень IL12 поддерживает поляризацию Th1, что обусловливает недостаточную функцию Th2.

Анализ полиморфного варианта CD14 rs2569190 С(-159)Т не выявил статистически значимых различий распространенности мажорного (59,5% и 55%) и минорного (40,5% и 45%) аллелей у пациентов с бронхиальной астмой по сравнению с контрольной группой.

Не было установлено различий показателей встречаемости гетерозиготного С(-159)Т и гомозиготных С(-159)С, Т(-159)Т генотипов по сравнению со здоровыми респондентами. Риск развития заболевания для гомозигот и гетерозигот или только для гомозигот не увеличивался в доминантной и рецессивной моделях (табл. 5).

В серии исследований, проведенных ранее, не подтверждено, что полиморфные варианты С159Т связаны с развитием бронхиальной астмы [7-9], в других – показано, что ген CD14 можно рассматривать в качестве гена-кандидата, увеличивающего восприимчивость к атопической бронхиальной астме [10, 11].

Таблица 5

Распределение частот аллелей и генотипов CD14 у больных бронхиальной астмой

Ген

Аллели

/генотип

БА

(n=100)

Контрольная группа

(n=50)

χ2

OR (95% CI)

 

CD 14

С(-159)T

C

119/200 (59,5%)

55/100 (55%)

p=0,46

1,20 (0,74–1,95)

T

81/200 (40,5%)

45/100 (45%)

p=0,46

0,83 (0,51–1,35)

 CC

37/100 (37%)

14/50 (28%)

p=0,36

1,51 (0,77–3,16)

 CT

43/100 (43%)

27/50 (54%)

p=0,27

1,76 (0,97–3,21)

 TT

20/100 (20%)

9/50 (18%)

p=0,94

1,14 (0,48–2,72)

p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)

OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал

Таблица 6

Доминантная и рецессивная модели распределения генотипов CD14 у больных бронхиальной астмой

Модель

Генотипы

БА

(n=100)

Контрольная

группа

χ2

OR (95% CI)

rs2569190 CD14

С(-159)Т

Доминантная

CC

37/100 (37%)

14/50 (28%)

p=0,36

0,66 (0,32–1,39)

CT+TT

63/100 (63%)

36/50 (72%)

rs2569190 CD14

С(-159)Т

Рецессивная

CT+CC

80/100 (80%)

41/50 (82%)

P=0,94

 

1,14 (0,48–2,72)

TT

20/100 (20%)

9/50 (18%)

p – достоверность различий по сравнению с контрольной группой (критерий χ2 Пирсона)

OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал

Установлено, что присутствие аллеля С в качестве полиморфного маркера CD14 ассоциировано с увеличением уровня общего IgE [11]. Вероятно, требуются дополнительные исследования по изучению генного полиморфизма CD14 в зависимости от фенотипа БА.

Выводы

  1. Полиморфизмы генов врожденного иммунитета TLR2 G2258A (rs5743708), TLR6 C745T (rs5743810) ассоциированы с развитием бронхиальной астмы у русских пациентов Юга России. Не установлено ассоциации полиморфных маркеров гена CD14 C(-159)T с развитием бронхиальной астмы.
  2. Молекулярно-генетическими маркерами повышенного риска развития бронхиальной астмы являются аллели TLR2 2258A, TLR6 745С. Протективными свойствами обладают генотипические варианты TLR2 G2258G и TLR6 C745С и аллель TLR2 2258G.

 


Библиографическая ссылка

Шушанова Л.В., Барычева Л.Ю., Минасян М.М., Душина Л.В. ПОЛИМОРФНЫЕ МАРКЕРЫ ГЕНОВ РЕЦЕПТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА У ВЗРОСЛЫХ ПАЦИЕНТОВ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ // Современные проблемы науки и образования. – 2018. – № 5. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=28066 (дата обращения: 05.12.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074