Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

На сегодняшний день рак молочной железы (РМЖ) по-прежнему занимает лидирующие позиции среди онкологических патологий у женщин в мире [1].

Генетическая предрасположенность является одним из главных факторов риска развития данного заболевания, на долю которого приходится от 5 до 10 % случаев всех злокачественных новообразований данной локализации [2].

В основе развития семейных форм РМЖ лежат наследственные мутации в генах BRCA 1/2, CHEK2, TP53, NBN, PALB2 и др. Однако около 30 % из всех наследственных случаев обусловлено мутациями в генах BRCA (Breast Cancer Associated) 1 и BRCA2. Эти гены относятся к высоко пенетрантным, функцией которых является участие в поддержании целостности генома и обеспечении репарации двойных разрывов ДНК, возникающих при воздействии различных повреждающих факторов [3].

Женщины, несущие наследственные мутации в гене BRCA1, имеют риск развития РМЖ 45–60 % в возрасте до 40 лет. В свою очередь, при наличии мутаций в гене BRCA2, риск РМЖ составляет 25–40 % [4]. Среди здоровых лиц можно выделить группу носителей мутаций, у которых онкологическая патология разовьется с высокой вероятностью в течение жизни. Также известно, что риск развития рака в контрлатеральной молочной железе в случае обнаружения мутантного типа гена BRCA в возрасте 41–50 лет составляет 6,3 %, в то время как среди больных старше 60 лет риск развития контрлатерального РМЖ равен нулю [4]. Генетически обусловленные формы РМЖ, в отличие от спорадических, имеют свои особенности течения и прогноза и требуют индивидуального подхода как в диагностике, так и в профилактике данного заболевания.

Международная база данных (Breast Cancer Information Core) содержит свыше 300 различных вариантов мутаций генов BRCA 1/2. Несмотря на то, что мутации генов BRCA1/2 чрезвычайно многообразны, при обследовании населения в разных странах часто можно проследить т.н. «эффект основателя» (foundereffect), заключающийся в преобладании каких-либо конкретных мутаций BRCA1/2 в данной популяции (табл.1). Так, повышенная частота мутаций BRCA1 185delAG, BRCA1 5382insC и BRCA2 6174delT характерна для евреев Ашкенази – на эти три мутации приходится 98−99 % всех мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 [5]. В Италии из всех обнаруженных мутаций в гене BRCA1 мутации BRCA1 3347delAG, BRCA1 3404delA, BRCA1 1499insA, BRCA1 5181delGTT составляют более 73 % [6]. Для Норвегии характерны мутации в гене BRCA11675delA, 3347delAG, 816delGT и 1135insA, на которые приходится свыше 68 % всех обнаруженных мутаций [7]. В Исландии практически единственной мутацией является 999del5 гена BRCA2 [8]. В странах Восточной Европы более чем в 70 % случаев выявляются мутации BRCA1 5382insC, BRCA1 4154delA и BRCA1 T300G [9-12].

Таблица 1

Спектр преобладающих мутаций в разных странах

Согласно ряду российских исследований преобладающими мутациями на территории Российской Федерации являются: 5382insC, С61G, 185delAG, 4154delA, 2080delA, 6174delТ, которые охватывают до 70–90 % всего спектра выявленных мутаций в этих генах. Однако большое количество работ доказывают тот факт, что спектр мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 разнится от региона к региону [13, 14, 15].

Влияние генетической предрасположенности к РМЖ у женщин в Южном Федеральном Округе изучено недостаточно, таким образом, целью нашей работы стало выявление спектра и частот встречаемости мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в популяциях ЮФО среди пациенток с клиническими признаками наследственного рака молочной железы.

Материалы и методы

Нами был проведен молекулярно-генетический анализ ДНК 133 пациенток с верифицированным РМЖ и клиническими признаками наследственного РМЖ, проходивших стационарное лечение в ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» (РНИОИ) Минздрава Российской Федерации, постоянно проживающих в ЮФО. Медиана возраста на момент постановки диагноза составляла 49 лет, а возраст варьировал в диапазоне от 24 до 79 лет.

При отборе пациенток для включения в исследование учитывались следующие клинические признаки [2,13]:

- молодой возраст начала заболевания (до 50 лет);

- онкологически отягощенный семейный анамнез;

- наличие первично-множественных опухолей;

-трипл-негативный статус рецепторов ER, PR, Her2.

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с помощью лизирующего SDS-содержащего буфера в присутствии протеиназы-К и последующей фенол-хлороформной экстракции. Концентрацию полученных препаратов ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0® (Invitrogen, США) с использованием набора Quant-iT™ dsDNA (HS) AssayKit (Invitrogen, США) и доводили до 2 нг/мкл. Постановку реакции ПЦР-амплификации проводили с помощью комплекта реагентов «BRCA-скрин» (ИнтерЛабСервис, Россия), предназначенного для определения 6 мутаций в генах BRCA1/2 (табл. 2) согласно протоколу производителя на термоциклере MaxygeneGradient (Axygen). Для идентификации ПЦР-продуктов использовали метод электрофореза в 2 % агарозном геле и систему гель-документирования GelDoc XR PLUS (BioRad, USA). В дальнейшем продукт амплификации подвергали очистке, денатурации и отмывке при помощи станции для пробоподготовки (VacuumPrepWorkstation, Qiagen, Germany). Затем одноцепочечный ПЦР-продукт отжигали с секвенирующими праймерами при 80 0С и использовали для проведения реакции пиросеквенирования в системе генетического анализа PyroMark Q24 (Qiagen, Germany). Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения PyroMark Q24 Software (Qiagen, Germany).

Таблица 2

Спектр анализируемых мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 с использованием набора реагентов "BRCA-скрин" («ИнтерЛабСервис», Россия):

Результаты и обсуждение

В ходе проведения молекулярно-генетического исследования 133 образца геномной ДНК выделенной из лейкоцитов периферической крови пациенток с клиническими признаками наследственного рака молочной железы были выявлены 19 образцов, несущих мутацию в исследованных генах, что составило 14,2 % (рис.1).

Из всего проанализированного спектра было выявлено два типа мутаций: 16 образцов несли мутацию 5382 insC в 20 экзоне гена BRCA1 и 3 образца содержали мутацию 300T>G в этом же гене. Генетических изменений в гене BRCA2, в рамках нашего исследования, не было выявлено.

Рис. 1. Частота и спектр мутаций в генах BRCA1 и BRCA2

Для пациенток, несущих мутации, были характерны инфильтрирующий протоковый, медулярный, билатеральный и криброзный раки. По гистологическим заключениям преобладала инфильтрирующая карцинома. Трижды негативный подтип РМЖ среди пациенток, имеющих мутации 5382 insC в гене BRCA1, был выявлен в двух случаях или в 12,5 % случаев от всех мутаций 5382 insC в гене BRCA1. Люминальный тип В наблюдался в 3 случаях (18,75 %), Неr2-положительными были 2 пациента (12,5 %), а люминальный А подтип встретился только 1 раз (6,25 %).

При анализе семейного онкологического анамнеза РМЖ был отмечен у 14 кровных родственников по материнской линии (76,9 %), у четырех пациенток с мутациями в гене BRCA1 5382 insC, в семейном анамнезе онкозаболеваний отмечено не было (23,1 %). Таким образом, можно сделать вывод, что сбор анамнеза о случаях онкологических заболеваний в семье не является достаточным и единственным критерием отбора при назначении молекулярно-генетического тестирования мутаций генов BRCA1/2.

В проведенном нами исследовании также была обнаружена мутация 300T>G в гене BRCA1 с частотой встречаемости данного типа мутаций 15,7 %. При гистологическом исследовании, так же, как и при наличии мутаций 5382insC в гене BRCA1 была отмечена инфильтрирующая протоковая карцинома. Возраст пациенток на момент постановки диагноза составлял 30, 48 и 60 лет. Семейный анамнез также был отягощен.

При оценке роли клинических составляющих наследственного РМЖ обнаружено, что у 10-ти пациенток (в 52,6 %) с сочетанием двух признаков наследственного РМЖ во всех случаях присутствовали мутации в гене BRCA1. У четырех пациенток с мутацией 5382 insC (21,1 %) в гене BRCA1 наблюдалось сочетание трех клинических признаков НРМЖ (молодой возраст манифестации заболевания, онкологически отягощенный анамнез и синхронный или метахронный рак). Одна пациентка (5,2 %), носительница мутантного аллеля, имела в личном анамнезе рак яичников. И четыре пациентки (21,05 %) имели лишь один из перечисленных признаков наследственного рака молочной железы.

Анализ распределения мутаций в зависимости от возраста показал (рис. 2), что наиболее часто мутации в гене BRCA1 манифестируются у пациенток в возрасте от 30–39 лет – 57,9 %, в группе 40–49 лет – 26,3 % и в группе старше 50 лет в 15,8 % случаев, что хорошо согласуется с критериями возрастной пенетрантности наследственного РМЖ.

Рис. 2. Встречаемость мутаций гена BRCA1 у пациенток с РМЖ в зависимости от возраста

Заключение

Результаты проведенного нами анализа наглядно демонстрируют качественный спектр и частоту встречаемости мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, аналогичную ранее проведенным исследованиям на территории Российской Федерации у пациенток славянской группы [12]. Это позволяет сделать вывод, что используемая нами диагностическая панель инструментов может быть корректно использована для скрининга «классических» наследственных полиморфизмов в генах BRCA1/2у пациенток Юга России, среди которых представители славянской группы составляют подавляющее большинство.