Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

COPYNUMBER VARITION OF 17 GENE IN THEGASTRIC ADENOCARCINOMA

Vodolazhskiy D.I. 1 Timoshkina N.N. 1 Maslov A.A. 1 Kolesnikov E.N. 1 Tatimov M.Z. 1
1 Rostov Research Institute of Oncology, the Russian Federation
The copy number variation (CNV) is common polymorphism of the genome, plays an important role in carcinogenesis of the stomach. The purpose of this study was to assess the change in the relative copy-size of 17 genetic loci in samples of tumor and conditionally normal gastric tissue in 47 patients with adenocarcinoma without metastatic regional lymph nodes (n = 18) and regional metastases (n = 29). According to the data obtained, genes with a rare aberrant copy (frequency less than 10 %) are identified: (P35, MDM2, MET, S6K2 <PIK3CA <IRX1 <AURKA), and genes with aberrant copying with a frequency of more than 10 % (HER2 <NFKB <C -MYC, POU5F1B <CCND1 <OCT1 <HV2). For two loci (APC and GKN1), it was not possible to detect CNV-changes in the tumor. Three nuclear loci (C-MYC, NFKB and POU5F1B) showed statistically significant differences in the discrimination of groups with localized and locally advanced forms of gastric cancer (OR = 8.95, 95 % CI: 1.04-77.37, P <0.05). Thus, amplification of C-MYC, NFKB and POU5F1Bgenes can be associated with the development of metastases in regional lymph nodes.
cnv
adenocarcinoma
gastric cancer
metastases

Варьирование числа копий участков ДНК человека (Copynumbervariation – CNV) относится к одному из видов полиморфизма, встречающемуся в нормальных клетках в процессе дифференцировки и функционирования, и затрагивающего, по меньшей мере, 10 % генома. Исследования последних лет свидетельствуют о важной роли аберрантных изменений CNV в онкогенезе [10]. Накопление CNV-событий в онкотрансформированных клетках может служить селективным фактором преимущества по сравнению с нормальными клетками тканей. В ряде работ были выявлены потери проапоптотических генов в образцах раковых опухолей желудка и одновременно противоположный процесс – амплификация генов, связанных с ростом, делением и метастазированием [1, 8].

Всё больше фактов свидетельствует о том, что CNV могут стать информативными биомаркерами для ранней диагностики рака желудка, последующего контролирования течения заболевания и эффективности терапии, а также служить маркерами таргетной химиотерапии. Кроме того, предложено использовать CNV для молекулярного субтипирования рака желудка [6, 7]. Не менее важной задачей является поиск прогностических маркеров метастазирования, так как метастазы возникают у 80–90 % больных раком желудка, при этом выживаемость составляет 65 % в случае ранней диагностики заболевания и менее 15 % на поздних стадиях процесса [12].

Цель настоящего исследования заключалась в изучении числа копий генетических локусов в неопластических опухолях желудка, как без признаков метастатического поражения регионарных лимфатических узлов, так и с метастазами в них. Относительную копийность (RCQ) определяли для 16-ти генов ядерной локализации – участников ключевых сигнальных путей, регулирующих рост клетки, выживание, метастазирование и устойчивость к химиотерапии, и некодирующего локуса митохондриальной ДНК (HV2), потеря копийности которой является наиболее распространенным событием при неоплазиях различной локализации.

Материалы и методы

Клиническим материалом для исследования относительной копийности генов служили ткани (опухолевые и условно здоровые) 47-ми пациентов Юга России с гистологически подтвержденным диагнозом аденокарциномы G2-G3 (Таблица 1), проходивших плановое лечение в ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ. Медиана возраста составила 67 лет (от 36 до 83 лет). Образцы тканей были получены в процессе хирургического вмешательства в период с 2015 по 2016 г. Все пациенты, вошедшие в данное исследование, имели ECOG статус от 1 до 2. Для работы с биоптатами пациентов были получены добровольные информированные согласия, в соответствии с этическим регламентом проведения медико-биологических исследований.

По клинической классификации заболевания были сформированы две группы пациентов: группа T3-4N0M0 с локализованной формой опухоли (n=18) и группа T3-4N1-2M0 с местнораспространенной формой рака желудка (n=29). Для верификации образцов тканей проводилось стандартное патолого-морфологическое исследование с окрашиванием фиксированных срезов гематоксилин-эозином. Биоптаты тканей после проведения патолого-морфологического исследования классифицировали на две группы: опухолевые (малигнизированные) и контрольные (не малигнизированные) образцы.

Таблица 1

Клинико-морфологическая характеристика пациентов

Характеристика

Переменные

Количество (%)

Клиническая классификация

T3-4N0M0

18 (38%)

T3-4N1-3M0

29 (62%)

Стадия дифференцировки опухоли (G)

2

24 (51%)

2-3

12 (26%)

3

11 (24%)

Пол

женщины

14 (30%)

мужчины

33 (70%)

Возраст, лет

<60

11 (23%)

>60

36 (77%)

 

Геномную ДНК экстрагировали из свежезамороженных операционных биоптатов тканей желудка с использованием лизирующего SDS-содержащего буфера в присутствии протеиназы-К и последующей фенол-хлороформной экстракцией [2]. Концентрацию полученных препаратов ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0® (Invitrogen, США) с использованием набора Quant-iT™ dsDNAHigh-Sensitivity (HS) AssayKit (Invitrogen, США).

Для определения дозы гена (RCQ) проводили ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). Прямые и обратные праймеры были разработаны с использованием соответствующих референсных последовательностей NCBI GenBank в программе Primer-BLAST. Каждые 25 мкл ПЦР-смеси содержали 10 нг геномной ДНК, 0,2mM dNTP’s, по 600 нМ прямого и обратного праймеров, 2,5 mM MgCl2, ПЦР-буфер, 0,05u/µl ДНК-полимеразы Thermusaquaticus («Синтол», Россия). В качестве красителя использовали EvaGreen (Biotium, США). Амплификацию каждой из проб осуществляли в трех повторностях. Количественную RT-qPCR проводили с использованием термоциклера CFX96 (Bio-Rad, США) в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе: 95 °C 3 мин., и 40 циклов при 95 °C 10 сек, 58 °C 30 секунд (чтение оптического сигнала FAM для красителя EvaGreen) и 72 °C 15 секунд. Первичные данные RT-qPCR получали с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager (ver. 2.1). Генетический локус GAPDH использовали в качестве референсного для нормализации полученных показателей количественной RT-qPCR.

Относительную копийность генетического локуса (RСQ) рассчитывали по формуле 2-ΔCt. Дозу исследованного локуса считали равной диплоидному набору (2n), если отношение RCQопухоль/норма ~1. Если отношение RCQопухоль/норма было > 1,5 или< 0,5, дозу локуса считали увеличенной (>3n) или уменьшенной (<1n), соответственно.

Статистический анализ проводили с помощью непараметрических критериев в программах Statisticav.7 и SPSSStatistics 19.

Результаты исследования и их обсуждение

Для всех вошедших в исследование пациентов были получены данные по копийности 17-ти генетических локусов. В целом, 33 образца неоплазий желудка (70 %) продемонстрировали амплификацию и/или потерю хотя бы по одному локусу. Среднее значение локусов амплифицированных и/или с потерей в группе T3-4N0M0 (без регионарных метастазов) составило 1,06+0,83 на одного пациента, а в группе T3-4N1-3M0 (с регионарными метастазами) – 2,14+2,2.

Выявлено аберрантное изменение RCQ 14-ти исследованных генов хромосомной локализации, за исключением АРС и GKN1 (рисунок 1).

Рис. 1. Частота амплификаций и потерь 16-ти генетических локусов в образцах аденокарциномы желудка

Потеря копийности зафиксирована для двух генов-онкосупрессоров (IRX1 и p53). Напротив, для 11-ти онкогенов было характерно увеличение относительной копийности, тем не менее в одном образце опухоли с регионарными метастазами была отмечена потеря копийности локуса CCND1, кодирующего белок циклин D1. Наиболее частыми CNV-изменениями в образцах аденокарциномы желудка стало уменьшение копийности локуса мтДНКHV2 в 15-ти случаях (32 %), кроме этого в трёх случаях HV2 был амплифицирован по сравнению с неопухолевой тканью желудка (рисунок 1).

Распределение случаев аберрантного изменения RCQ по локусам в исследованной выборке в зависимости от ряда клинико-патологических показателей приведено в таблице 2.

Таблица 2

Клинико-морфологические характеристики и частота аберрантных RCQ в исследованных локусах

Локус

Возраст

Пол

 

G

N-классификация

<60, (%)

>60, (%)

P*

мужчины, (%)

женщины, (%)

P

G2, (%)

G2-3, (%)

P

N0, (%)

N1-3, (%)

P

c-myc

1(9)

8(22)

0,595

6(18)

3(21)

0,883

2(8)

7(30)

0,056

1(6)

7(24)

0,099

p53

0

1(3)

0,526

1(3)

0

0,655

1(4)

0

0,982

0

1(3)

0,807

mdm2

0

1(3)

0,526

1(3)

0

0,655

0

1(4)

0,983

0

1(3)

0,807

nfkb

1(9)

7(19)

0,734

7(21)

1(7)

0,453

3(13)

5(22)

0,649

0

7(24)

0,047

aurka

1(9)

2(6)

0,775

2(6)

1(7)

0,607

0

3(13)

0,070

0

3(10)

0,425

ccnd1

2(18)

8(22)

0,893

10(30)

0

0,053

5(21)

5(22)

0,779

4(22)

6(21)

0,808

her2

2(18)

4(11)

0,921

3(9)

3(21)

0,490

4(17)

2(9)

0,703

1(6)

5(17)

0,433

hv2

5

13(36)

0,838

13(39)

5(36)

0,928

8(33)

10(44)

0,678

8(44)

10(35)

0,708

irx1

2(18)

3

0,713

4(12)

1(7)

0,991

2(8)

3(13)

0,959

1(6)

4(14)

0,405

met

0

1(3)

0,526

1(3)

0

0,655

1(4)

0

0,982

0

1(3)

0,807

pik3ca

1(9)

3(8)

0,890

3(9)

1(7)

0,724

1(4)

3(13)

0,570

1(6)

3(10)

0,480

pou5f1b

1(9)

10(28)

0,382

9(27)

2(14)

0,626

3(13)

8(35)

0,074

1(6)

10(35)

0,045

s6k2

1(9)

1(3)

0,956

2(6)

0

0,879

0

2(9)

0,451

0

2(7)

0,692

oct1

4(36)

8(22)

0,585

11

1(7)

0,129

6(25)

6(26)

0,803

4(22)

8(28)

0,947

N

11

36

 

33

14

 

24

23

 

18

29

 

Примечание: * – вероятность в χ2-тесте.

Статистический анализ данных выявил тенденцию влияния пола на частоту изменения числа копий гена ccnd1 (р=0,053), все 10 случаев аберрантных RCQccnd1 были определены у мужчин. В качестве тенденции также определена ассоциация амплификации двух локусов aurka и pou5f1b с низкой степенью дифференцировки (G3) опухоли (Р=0,070 и Р=0,074, соответственно). Дискриминация групп с локализованной формой опухоли (T3-4N0M0) и местнораспространенной формой рака желудка (T3-4N1-3M0) возможна по двум исследованным ядерным локусам nfkb и pou5f1b 2= 5,10 и 5,18, соответственно, Р<0,05). В группе T3-4N1-3M0 частота амплификации гена nfkb составила 24 %, гена pou5f1b – 34 %, тогда как в группе T3-4N0M0 изменений RCQ локуса nfkb не было зафиксировано, а амплификация pou5f1b отмечена в 6 % опухолей (OR=8,95, 95 %CI: 1,035-77,37, P<0,05). Потенциально для идентификации местнораспространенной формы рака желудка возможно использование ещё одного онкогена c-myc, амплификация которого также преобладала в группе T3-4N1-3M02=2,72, Р=0,099).

Корреляционный анализ полученных данных выявил статистически достоверные ассоциации между амплификацией трёх локусов c-myc, nfkb, pou5f1b и метастазированием в региональные лимфоузлы (р=0,026; 0,009; 0,009, соответственно), а также степенью дифференцировки опухоли (р=0,042; 0,014;0,016, соответственно).

Отметим, что в группе T3-4N1-3M0 статистически достоверно коррелировала амплификация генов C-MYCи POU5F1B (R=0,609, р<0,01), локализованных рядом на 8q24 хромосоме.

Ранее нами обсуждалось снижение числа копий митохондриальной ДНК (мтДНК), оцениваемое по RCQ локуса HV2, в различных гистологических типах рака желудка относительно нормальных клеток и по мере потери дифференцировки опухоли [1]. Тенденция снижения числа копий мтДНК, как отражение известного эффекта Варбурга – перехода малигнизированных клеток в режим преимущественного использования гликолиза [9], отражена и в настоящем исследовании, однако данный маркер не дискриминировал опухоли с метастазами в регионарные лимфоузлы. Тем не менее частота снижения числа копий HV2 в группе с локализованной формой опухоли составила 44 % против 28 % в группе с местнораспространенной формой рака желудка. Кроме того, в последней присутствовали два случая амплификации локуса HV2. Полученная тенденция согласуется с описанным повышением копийности мтДНК в опухолевых тканях у пациентов с метастазами, что может отражать особенности энергетического метаболизма, переводящей клетки в аэробный режим для обеспечения их распространения из первичного очага в другие органы [9].

Одной из основных задач исследования CNV генома является выявление нарушения баланса онкогенов и онкосупрессоров, которые вызывают функциональные нарушения в клетке, способствующие её малигнизации. Согласно литературным данным охарактеризованы изменения копийности множества генов в опухолях различного происхождения. Отметим однако, что оценки встречаемости изменения копийности одного и того же гена часто значительно разнятся. Так, приводимые частоты амплификации онкогена HER2, ассоциированного, как правило, с плохим прогнозом заболевания, варьируют от 6 до 23 % от числа исследованных случаев рака желудка [7]. Вклад в вариативность оценок, по-видимому, могут вносить как методы и схема исследования, так и популяционная принадлежность пациентов. Например, в двух недавних работах методами PCR-RT и FISН оценивалась копийность другого онкогена MET, который считают перспективным в качестве мишени для таргетной терапии при раке желудка. Относительно высокая частота амплификации гена MET (21,8 %) была определена группой Haetal. [3], исследовавших пациентов этнических корейцев (n=495). В работе Janijisiaetal. [5], изучавших пациентов западных регионов США (n=38), амплификации MET не было обнаружено, несмотря на повышенную экспрессию мРНК и белка в 63 % и 50 % случаев, соответственно.

В нашей работе не были идентифицированы образцы опухолей с аберрантной копийностью генов APC и GKN1, что может быть обусловлено и недостаточной численностью выборки для идентификации редких событий, и популяционным составом выборки пациентов (европеоиды), а также ограничениями при формировании групп сравнения (отбирали опухоли с инвазией всех слоев желудка – Т3-4). Экспрессия гена GKN1, недавно идентифицированного мощного супрессора опухоли желудка, значительно падает в большинстве метаплазий и раковых опухолях [15]. Однако механизмы негативной регуляции активности GKN1 изучены недостаточно, рассматривается участие в этом процессе, как уменьшение копий гена, так и инактивирующие мутации и гиперметилирование промотора.

В целом, выявленные нами частоты аберрантных RCQ в злокачественных опухолях желудка T3-4N0-3M0 в большинстве случаев согласуются с данными более ранних исследований. Условно генетические локусы, вошедшие в настоящую работу, можно разделить на группу, показатели аберрантной относительной копийности которых редко изменяются при малигнизации (частота менее 10 %), такие как – P35, MDM2, AURKA, IRX1, MET, PIK3CA, S6K2, и на группу, показатели RCQ которых чаще изменяются при малигнизации тканей желудка, такие как – C-MYC, NFKB, CCND1, HER2, HV2, POU5F1B, OCT1.

Два из 17-ти исследованных локусов продемонстрировали статистическую значимость для дискриминации групп T3-4N0M0 и T3-4N1-3M0-NFKB (чувствительность Se-88 %; специфичность Sp – 45 %) и POU5F1B(Se-91 %; Sp – 47 %); в отношении локуса C-MYC наблюдалась тенденция влияния на риск образования метастазов (чувствительность Se-78 %; специфичность Sp – 44 %). Ранее сообщалось о значительном увеличении числа копий гена с-Мyс в процессе канцерогенеза [11], в том числе была показана тесная связь этого события с глубиной метастазов в лимфатических узлах и инвазией опухоли желудка [13]. Для гена POU5F1B с ещё не вполне описанными функциями была продемонстрирована связь увеличения числа копий и избыточной экспрессии при раке желудка, что в свою очередь, коррелировало с ростом опухоли [4]. Биологическое значение активации ядерного фактора-каппа-B (NF-kappaB) в неопластических образованиях желудка человека неясно. Тем не менее была выявлена ассоциация активации NF-kappa B с канцерогенезом, агрессивностью опухоли желудка и инфекцией H.pylori с повышенной экспрессией MMP-9, IL-1beta и IL-8 [14].

В целом, обнаружение в опухоли желудка амплификации по одному из трёх описанных выше маркеров и/или изменение RCQ более чем по двум ядерным локусам, оцененным в настоящей работе, повышает риск метастазирования в регионарные лимфатические узлы в 6,9 раз (OR=6,933; 95 % CI:1.3-35.3; Se – 87 %, Sp – 52 %).

Заключение

Относительная копийность исследованных генетических локусов в опухолях желудка разных N-типов изменяется не одинаково. Для аденокарцином T3-4N1-3M0, в отличие от аденокарцином T3-4N0M0, характерна амплификация онкогенов NFKB и POU5F1B.