Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

PATHOGENETIC MECHANISMS OF ALOPECIA AREATA ACCORDING BIOINFORMATIC ANALYSIS

Nikolaeva T.V 1
1 Orenburg State Medical University, Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Для определения вероятных молекулярных механизмов был проведен биоинформационный анализ с использованием ресурсов STRING (Search Tool for Retrieval of Interacting Gines/Proteins) и KEGG (Kioto Encyclopedia of Genes and Genomes). При учете полученных результатов введена поправка на множественные сравнения с использованием подхода False Discovery Rate (FDR). Результаты считались статистически значимыми, если величина скорректированного р-значения не превышала уровень значимости 0,01. Исходными данными для биоинформационного анализа явились данные о генах, ассоциированных с гнездной алопецией, установленные методом полногеномного анализа ассоциаций. Установлено, что в патогенезе ГА принимают участие «Сигнальный путь Т-клеточного рецептора» (hsa04660; скорректированная величина р=0,0009), в который вовлечены белковые продукты генов CTLA4, ICOS и IL2; сигнальный путь «Молекулы клеточной адгезии» (hsa04514; скорректированная величина р=0,002) с вовлечением белковых продуктов генов HLA-DQA2, CTLA4 и ICOS; «Jak-STAT сигнальный путь» (hsa04630; скорректированная величина р=0,002) и сигнальный путь «Цитокин-цитокиновое рецепторное взаимодействие» (hsa04060; скорректированная величина р=0,006), в каждом из которых принимают участие белковые продукты генов IL2RA, IL2 и IL21. Дальнейшие исследования будут способствовать разработке эффективных фармакотерапевтических подходов.
To determine the possible molecular mechanisms involved in the pathogenesis of alopecia areata bioinformatic analysis was performed using resources STRING (Search Tool for Retrieval of Interacting Gines / Proteins) and KEGG (Kioto Encyclopedia of Genes and Genomes). It was corrected for multiple comparisons using the approach False Discovery Rate (FDR). The results were considered statistically significant if the p-value adjusted value does not exceed the level of significance 0.01. The initial data for the bioinformatic analysis were data on genes associated with alopecia areata established by genome-wide association analysis. It has been discovered that HA pathogenesis participate "signaling pathway of T-cell receptor» (hsa04660; Adjusted p-value = 0.0009), which is involved in the protein gene products of CTLA4, ICOS and IL2; signaling "cell adhesion molecules» (hsa04514; adjusted p-value = 0.002) with the involvement of the protein products of genes HLA-DQA2, CTLA4 and ICOS; «Jak-STAT signaling pathway» (hsa04630; adjusted p-value = 0.002) and the signaling pathway "cytokine-cytokine receptor interaction» (hsa04060; adjusted p-value = 0.006), all of which are involved protein gene products IL2RA, IL2 and IL21. Further studies will contribute to the development of effective pharmacological approaches.
alopecia areata
bioinformatic analysis
signaling pathway
pathogenesis.

Современная концепция патогенеза ГА основана на гипотезе утраты волосяным фолликулом иммунной привилегии [12; 16]. Предполагается, что в результате воздействия средовых триггерных факторов у генетически предрасположенных лиц возрастает внутрифолликулярный уровень IFN-γ [16]. Это индуцирует эктопическую экспрессию молекул MHC I класса кератиноцитами проксимальной части волосяного фолликула с последующей презентацией меланоцит- или анаген-ассоциированных аутоантигенов цитотоксическим CD8+ Т-лимфоцитам, увеличивает продукцию кератиноцитами IL-6, IL-8 и индуцирует экспрессию эпидермальными кератиноцитами молекул межклеточной адгезии 1 (ICAM-1) и HLA-DR (молекул MHC II класса), которые активируют приток CD4+ Т-лимфоцитов (Т хелперов 1 типа) с последующим выделением ими провоспалительных цитокинов IFN-γ, IL-2, IL-1β [16;  17]. Перифолликулярный инфильтрат при ГА, помимо CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, содержит IFN-γ-синтезирующие NKG2D+ естественные киллеры (NK-клетки) [23] и клетки Лангерганса [28]. IFN-γ является мощным индуктором катагена [17], TNF-α, IL-1α и IL-1β ингибируют пролиферацию кератиноцитов [14], нарушают рост волосяного фолликула [13; 14]. Кроме того, при ГА имеется дисбаланс уровней провоспалительных Т-хелперов 17 типа и предотвращающих иммунный ответ на аутоантигены регуляторных CD4 + CD25 + Т-клеток со снижением количества и функциональной активности последних [23].

Понимание генетических основ восприимчивости к мультифакториальным заболеваниям предполагает раскрытие биологической роли генов с точки зрения их вовлеченности в механизмы, способные влиять на развитие болезни [19]. Известно, что в основе большинства биологических процессов лежат взаимодействия между белками. Анализ белок-белковых взаимодействий, присущих тому или иному заболеванию, является важным инструментом в установлении механизмов его развития [6]. Принимая во внимание вышеизложенное, целью исследования явился анализ белковых взаимодействий между продуктами генов, ассоциированных по данным полногеномного анализа ассоциаций с ГА.

Материалы и методы исследования

Основанием для выполнения биоинформационного анализа явилось выполненное репликативное ассоциативное исследование, результаты которого изложены в научной литературе [5]. Оно показало, что в российской популяции из восьми полиморфизмов ассоциированными с фенотипом ГА оказались только rs1024161 гена CTLA4, rs694739 гена PRDX5, rs1701704 гена IKZF4 и rs10760706 гена STX17. Учитывая, что вероятной причиной отсутствия ассоциации фенотипа ГА с остальными полиморфизмами может явиться относительно малый объем выборки (105 пациентов с ГА и 100 здоровых лиц), биоинформационный анализ был выполнен с включением всех восьми полиморфных маркеров, ассоциированных по данным GWAS с ГА. Исходными для проведения биоинформационного анализа явились данные международной базы данных Каталога опубликованных геномных ассоциативных исследований Национального института исследований генома человека (США) (The NHGRI-EBI Catalog of published genome-wide association studies) [3], были отобраны восемь однонуклеотидных полиморфизмов генов, ассоциированных по данным всегеномного анализа ассоциаций (GWAS – genom-wide association study) с ГА [23]. Они включали следующие однонуклеотидные полиморфизмы: rs9275572 (ген HLA-DQA2), rs9479482 (ген ULBP3, ULBP6), rs1024161 (ген CTLA4, ICOS), rs3118470 (ген IL2RA), rs1701704 (IKZF4), rs7682241 (IL2 – IL21), rs694739 (PRDX5), rs10760706 (STX17). Для проведения анализа взаимодействия белковых продуктов генов, ассоциированных с ГА, использован ресурс STRING (Search Tool for Retrieval of Interacting Gines/Proteins) [2] и база данных KEGG (Kioto Encyclopedia of Genes and Genomes) [1]. При проведении биоинформационного анализа введена поправка на множественные сравнения с использованием подхода False Discovery Rate (FDR) [7]. Результаты считались статистически значимыми, если скорректированная величина р-значения не превышала уровень значимости 0,01.

Результаты и их обсуждение

Проведенный анализ KEGG-путей показал, что при ГА имеет место активация Jak-STAT (Janus Kinases - Signal Transducer and Activator of Transcription) сигнального пути (hsa04630; скорректированная величина р=0,002). Это согласуется с данными зарубежных исследователей, основанными на функциональном анализе 14 генов, ассоциированных с ГА [22]. Функциональная роль этого пути состоит в передаче информации от внеклеточных сигналов с рецепторов цитокинов и интерферонов через трансмембранные рецепторы непосредственно к промоторам генов-мишеней в ядре клетки и обеспечении ответа на эти стимулы функциональной активацией клеток-мишеней [24]. Из совокупности генов, ассоциированных с ГА, участниками этого сигнального пути стали гены IL2, IL2RA, IL21. Продуктом гена IL2 является цитокин интерлейкин-2 (IL-2), продуцируемый активированными Т-клетками. IL-2 является важнейшим посредником, индуцирующим иммунологическую реакцию против волосяных фолликулов при ГА [23]. Он обладает как провоспалительными эффектами, увеличивая цитотоксическую активность IFN-γ-продуцирующих CD8+ Т-клеток и NK-клеток, так и противовоспалительными эффектами, обеспечивая поддержание популяции регуляторных Т-клеток [24]. Ген IL2RA кодирует часть рецепторного комплекса IL2, тем самым опосредуя Jak-STAT сигнальный путь, активируемый IL-2 [18], в том числе в CD4+CD25+ регуляторных Т-клетках [11]. Эти клетки играют ключевую роль в предотвращении иммунных реакций против аутоантигенов [11]. Дифференцировка регуляторных Т-клеток зависит от ранней экспрессии IL-2RА, а также фактора транскрипции Foxp3, активация экспрессии которого интерлейкином-2 является залогом эффективного подавления иммунных реакций [23]. Нарушение функциональной активности генов IL2 и IL2RA, вероятно, приводит к снижению уровня регуляторных Т-клеток, неконтролируемому накоплению активированных Т-клеток на периферии, способствуя патогенезу ГА [13]. Ген IL21, находящийся в одной хромосомной области с геном IL-2, также участвует в регуляции баланса между иммунной толерантностью и эффекторными иммунными реакциями [10; 23]. Продукт гена IL-21 обладает плейотропным действием на различные клеточные клоны, включая CD8+ Т-клетки, NK-клетки и дендритные клетки. Цитокины IL-21 и IL2, выступая в роли синергистов, стимулируют продукцию IFN-γ Т- и NK-клетками [10], но обладают функциональным антагонизмом по отношению к дифференцировке регуляторных Т-клеток, при этом IL-21 подавляет этот процесс [10; 23].

Нарушение цитокинового баланса и функциональной активности рецепторов цитокинов имеет решающее значение в развитии иммунопатологических реакций. В частности, рассмотренные выше продукты генов IL2, IL2RA, IL21, ассоциированных с ГА, вероятно, оказывают влияние на динамическое взаимодействие между иммунными клетками, способствуя поддержанию коллапса иммунной привилегии волосяного фолликула и преобладанию иммунных реакций, направленных на аутоантигены. Это объясняет то, что гены IL2, IL2RA, IL21 при анализе KEGG-путей оказались объединены еще одним сигнальным путем «Цитокин-цитокиновое рецепторное взаимодействие» (hsa04060; скорректированная величина р=0,006), активация которого свидетельствует о значимости цитокиновой регуляции в патогенезе ГА. Важно отметить, что IFN-γ реализует свои эффекты на клетки-мишени с использованием двух описанных выше сигнальных путей [1]. С влиянием IFN-γ, считающегося основным провоспалительным цитокином, связывают ряд ключевых моментов патогенеза ГА: коллапс иммунной привилегии волосяного фолликула путем усиления экспрессии молекул МНС I и II класса и молекул межклеточной адгезии 1 типа (ICAM-1, intercellular adhesion molecule-1), что делает возможным распознавание аутоантигенов волосяного фолликула с последующей атакой CD4 + и CD8 + аутореактивными цитотоксическими Т-клетками [20].

Проведенный анализ свидетельствует об активации KEGG-пути «Молекулы клеточной адгезии» (hsa04514; скорректированная величина р=0,002), участниками которого явились продукты генов HLA-DQA2, CTLA4, ICOS, вовлеченные в антиген-специфический иммунный ответ.  Известно, что в здоровой коже экспрессия молекул МНС II класса на кератиноцитах волосяного фолликула отсутствует [13; 15], кроме того, немногочисленные клетки Лангерганса (антигенпрезентирующие клетки) в проксимальной части волосяного фолликула функционально неполноценны [20]. Возрастание внутрифолликулярного уровня IFN-γ приводит к увеличению количества клеток Лангерганса [9; 29] и аберрантной экспрессии молекул ICAM-1, МНС I и II класса на кератиноцитах волосяного фолликула [13]. С одной стороны, увеличение экспрессии MHC II класса может в целом предрасполагать к развитию аутоиммунных реакций с помощью различных механизмов: путем изменения репертуара Т-клеточных рецепторов в процессе их дифференцировки в тимусе, влияя на выживаемость Т-клеток, изменяя секрецию цитокинов [8]. С другой стороны, экспрессия молекул MHC II класса на кератиноцитах волосяных фолликулов и клетках Лангерганса может приводить к активации Т-клеток в перифолликулярной области. Известно, что CD4+ Т-клетки – клеточный клон, способный распознавать МНС II класса. Возможно, при ГА молекулы МНС II класса HLA-DQA2, экспрессирующиеся на поверхности кератиноцитов волосяного фолликула и антигенпрезентирующих клетках (клетках Лангерганса), активируют CD4+ Т-клетки [21]. Процесс активации CD4+ Т-клеток обусловлен связыванием Т-клеточного рецептора (ТКР) с антигеном, презентированным в комплексе с молекулами MHC II класса и взаимодействием костимулирующих рецепторов – Т-клеточного рецептора (CD28) и индуцируемого Т-клеточного костимулятора (ICOS), и коингибирующего рецептора CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, белок 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами) с их лигандами на поверхности антигенпрезентирующих клеток [25]. Взаимодействие костимулирующих Т-клеточных рецепторов с лигандами антигенпрезентирующих клеток увеличивает антиген-специфическую пролиферацию CD4+ Т-клеток, усиливает выработку цитокинов, индуцирующих созревание эффекторных CD8+ Т-клеток [27], способствует выживанию Т-клеток, и, напротив, взаимодействие их с белком CTLA4 ингибирует пролиферацию Т-клеток [25]. Вероятно, полиморфизм генов CTLA4 и ICOS, ассоциированных с ГА, приводит к дерегуляции функциональной активности Т-клеток и поддержанию аутоагрессии против волосяных фолликулов. В процессе антиген-специфического иммунного ответа механическое взаимодействие между клетками обеспечивают молекулы клеточной адгезии [1]. Это объединяет белки, кодируемые генами HLA-DQA2, CTLA4 и ICOS, участвующими в аутоиммунном процессе при ГА, одним сигнальным путем «Молекулы клеточной адгезии» (hsa04514).

В результате проведенного анализа KEGG-путей выявлен сигнальный путь Т-клеточного рецептора (hsa04660; скорректированная величина р=0,0009). В него вовлечены гены CTLA4, ICOS и IL2. Аберрантная Т-клеточная сигнализация является основой развития аутоиммунных заболеваний [26]. Как показано выше, исходным для активации Т-клеток является антиген-специфический сигнал, возникающий при связывании Т-клеточного рецептора (ТКР) с комплексом, состоящим из молекулы МНС и пептидного антигена, модулируемый в дальнейшем сигнализацией с корецепторов [26], в том числе кодируемых генами CTLA4 и ICOS. Указанные рецепторные взаимодействия инициируют ряд сигнальных каскадов, которые регулируют общие и специализированные функции Т-клеток (пролиферацию, продукцию цитокинов, дифференцировку в эффекторные клетки) [1]. Продукт гена IL2 является фактором роста Т-клеток [24], участвует в регуляции пролиферации CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов [4], кроме того, антиген-индуцированный иммунный ответ Т-клеток критически регулируется взаимодействием IL2 с высокоаффинным рецепторным комплексом IL-2R [18]. Функциональная роль IL2, вероятно, обусловила участие этого гена в сигнальном пути Т-клеточного рецептора.

Вовлеченность генов ULBP3/ULBP6, IKZF4, STX17 и PRDX5 в какие-либо метаболические пути в настоящем исследовании не установлена.

В физиологических условиях кератиноциты волосяного фолликула человека не экспрессируют кластер генов ULBP (белок, связывающий антиген UL-16 цитомегаловируса). Однако при ГА экспрессия этих белков, в частности ULBP3, значительно возрастает [23]. ULBP3 является лигандом для рецептора натуральных киллеров группы 2, представителя D (NKG2D, natural killer group 2 member D). Установлено, что аутоиммунная деструкция волосяных фолликулов при ГА обусловлена CD8+ Т-клетками и естественными киллерами (NK-клетками) [12], которые привлекаются в волосяной фолликул с помощью NKG2D-активирующего лиганда.

Белковый продукт гена IKZF4 является членом семейства цинк-пальцевых транскрипционных факторов Ikaros [23]. IKZF4 экспрессируется в лимфоцитах и участвует в регуляции развития лимфоидных клеток. Он играет ключевую роль в качестве репрессора экспрессии генов [28]. Регуляторные Т-клетки, как известно, поддерживают иммунологическую аутотолерантность и иммунный гомеостаз путем подавления аберрантных иммунных реакций. Возможно, что изменение функциональной активности гена IKZF4 может играть роль в аутоиммунных реакциях.

Ген STX17 кодирует белок, принадлежащий к надсемейству SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor accessory-protein receptor, растворимые белковые рецепторы прикрепления N-этилмалеимид-чувствительного фактора). Это группа белков, участвующих в слиянии внутриклеточных мембран, везикулярном транспорте и осуществляющих процесс аутофагии путем слияния мембран аутофагосом с мембраной лизосом. Ассоциации с какими-либо заболеваниями человека, помимо ГА, установлены не были [23]. Его роль в патогенезе ГА еще предстоит определить.

Продуктом гена PRDX5 является внутриклеточный антиоксидантный фермент PRDX5 [23], относящийся к семейству ферментов пероксиредоксинов, ответственных за преобразование активных форм кислорода в безвредные побочные продукты и, кроме того, модуляцию Н2О2-зависимых сигнальных путей, активирующих рецепторы цитокинов и факторов роста. PRDX5 экспрессируется во многих тканях, в том числе волосяных фолликулах, и индуцируется в условиях клеточного стресса [23]. Активация экспрессии PRDX5 может способствовать выживанию аберрантных клеток, способных презентировать аутоантигены иммунной системе и способствовать возникновению аутоиммунного процесса.

Таким образом, проведенный биоинформационный анализ, основанный на данных полногеномного анализа ассоциаций, показал, что в патогенезе ГА принимают участие «Сигнальный путь Т-клеточного рецептора» (hsa04660), в который вовлечены белковые продукты генов CTLA4, ICOS и IL2; сигнальный путь «Молекулы клеточной адгезии» (hsa04514) с вовлечением белковых продуктов генов HLA-DQA2, CTLA4 и ICOS; «Jak-STAT сигнальный путь» (hsa04630) и сигнальный путь «Цитокин-цитокиновое рецепторное взаимодействие» (hsa04060), в каждом из которых принимают участие белковые продукты генов IL2RA, IL2 и IL21. Дальнейшие исследования, направленные на поиск молекулярных путей, участвующих в патогенезе ГА, будут способствовать разработке эффективных фармакотерапевтических подходов.