Хроническая ишемия головного мозга (ХИМ), являющаяся разновидностью сосудистой церебральной патологии, характеризуется медленно прогрессирующим диффузным нарушением кровоснабжения головного мозга с постепенно нарастающими разнообразными дефектами его функционирования, является одной ведущих причин тяжелой инвалидизации и смертности больных в большинстве развитых стран и представляет не только медицинскую, но и серьезные социальные и экономические проблемы не только в России, но и в мире [5; 12].
Основными причинами возникновения ХИМ являются атеросклероз и артериальная гипертония, а в патогенезе заболевания большое значение имеет активация перекисного окисления липидов, иммунологическая и эндотелиальная дисфункция, воспаление [3; 5], а, с учетом немногочисленных литературных данных, определенную роль при развитии заболевания играют нарушения в структурно-функциональных свойствах эритроцитов [7]. В то же время в литературе недостаточно освещены вопросы о патогенетической роли эритроцитов в возникновении и развитии ХИМ и почти не изучена возможность фармакологической коррекции этих нарушений на разных стадиях заболевания.
Цель исследования – установление эффективности фармакологической коррекции препаратами антиоксидантного и иммуномодулирующего действия нарушений функционально-структурных свойств эритроцитов при хронической ишемии мозга I и II стадии.
Материалы и методы
Обследовано 11 больных мужского пола и 31 женского, составивших основную группу, в неврологическом отделении БМУ «Курская областная клиническая больница» с ХИМ на фоне гипертонической болезни II стадии в возрасте 50±5 лет. Изучены также лабораторные показатели в эритроцитах 16 здоровых доноров (52±2 года), сформировавших контрольную группу.
Пациенты основной группы после разделения методом случайной рандомизации на 4 подгруппы по 10-11 человек получали базовую фармакологическую терапию в течение 14 дней: ингибитор ангиотензин-превращающего фермента эналаприла малеат (Берлиприл, Германия) по 10 мг в сутки внутрь; вазоактивный препарат Кавинтон (ОАО «Гедеон Рихтер», Венгрия) по 10 мг внутривенно, капельно; ноотроп Цераксон («Сотекс Фармфирма», Россия) по 1000 мг внутривенно, струйно. Больные также получали антиоксидант Мексикор («ЭкоФармИнвест», Россия) по 100 мг 2 раза в сутки внутривенно, струйно; а пациенты 2-й и 4-й подгрупп дополнительно получали иммуномодулятор Глутоксим («ФАРМА ВАМ», Россия) 30 мг, внутримышечно. Всем пациентам проводили комплексное клинико-инструментальное обследование по общепринятым стандартам, при этом во всех случаях имела место верификация диагноза ХИМ I и II стадии. Оценку клинико-лабораторных данных в основных группах осуществляли в начале лечения и через 2 недели после его окончания.
Эритроциты получали из 10 мл гепаринизированной крови, определяли сорбционную способность эритроцитов (ССЭ) [13] и сорбционную емкость их гликокаликса (СЕГ) [11]. Мембраны эритроцитов выделяли методом G.T. Dodge [15], липиды мембран определяли методом тонкослойной хроматографии [8]. Электрофорез белков проводили в присутствии додецилсульфата натрия в вертикальных пластинах полиакриламидного геля по методу U.K. Laemmli [16].
Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию в эритроцитах ацилгидроперекисей (АГП) и малонового диальдегида (МДА), образующих с тиобарбитуровой кислотой окрашенный комплекс. Определение МДА и АГП проводили с помощью набора «ТБК-Агат» («Агат-Мед» Россия), при использовании спектрофотометра «Апель-330» (Япония) при длине волны 535 и 570 нм. Для оценки состояния антиоксидантной системы использовали метод прямого/конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с детекцией продуктов реакции в диапазоне длины волны 405-630 нм с применением готовых коммерческих наборов: активность супероксиддисмутазы (СОД) Bender Medsystems (Австрия) и каталазы Cayman Chemical (США). Общую антиокислительную активность (ОАА) определяли методом, основанным на степени ингибирования аскорбат- и ферроиндуцированного окисления твина-80 до МДА. Уровень стабильных метаболитов оксида азота (СМON) выявляли с использованием двух аналитических операций: измерение эндогенного нитрита и превращение нитрата в нитрит с использованием нитрит-редуктазы с последующим измерением общего нитрита по абсорбции азокрасителя в реакции Грисса при длине волны 540 нм с применением набора для ИФА фирмы R&D (Англия). Регистрация всех результатов ИФА осуществлялась при помощи микропланшетного фотометра Sunrise, Tecan (Австрия).
Статистическую обработку результатов исследования проводили по общепринятым критериям вариационно-статистического анализа с вычислением средних величин (M), ошибки средней арифметической (m) с помощью пакета компьютерных программ Microsoft Excel, 2010. Существенность различий оценивали по U-критерию. Статистически значимыми считали различия с p < 0,05.
Результаты и их обсуждение
До лечения у больных с I стадией ХИМ установлено снижение в эритроцитарной мембране содержания α- и β-спектрина, анкирина, паллидина, белка полосы 4.5, дематина, глицеральальдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Г-3-ФД) при повышении уровня анионтранспортного белка (АТБ), актина, тропомиозина при нормальном содержании белка полосы 4.1 и глутатион-S-трансферазы (Г-S-Т). Проведенная фармакологическая терапия с включением или без Глутоксима корригирует в сторону параметра здоровых доноров уровень актина и нормализует содержание остальных измененных эритроцитарных белков (табл. 1).
Таблица 1
Изменения белкового спектра мембраны эритроцитов у пациентов с ХИМ I и II стадии до и после фармакологической терапии (M±m)
|
Показатели |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
|
Здоровые |
ХИМ-1 |
ХИМ-2 |
||||||
|
До лечения |
После лечения |
До лечения
|
После лечения |
|||||
|
Мексикор |
Мексикор+ Глутоксим |
Мексикор |
Мексикор+ Глутоксим |
|||||
|
α-спектрин |
110,8±2,4 |
98,9±1,9*1 |
113,7±2,2*2 |
115,3±3,7*2 |
94,7±2,4*1 |
109,7±2,3*5 |
109,1±1,6*5 |
|
|
β-спектрин |
106,1±2,0 |
96,6±2,7*1 |
108,8±1,4*2 |
110,4±3,4*2 |
93,3±2,6*1 |
99,8±3,1*1,5 |
110,1±2,7*5,6 |
|
|
Анкирин |
100,5±1,6 |
75,2±1,9*1 |
100,0±2,2*2 |
103,2±2,4*2 |
74,9±2,3*1 |
96,2±1,9*1,5 |
95,6±2,1*1,5 |
|
|
АТБ |
153,8±3,6 |
170,7±4,3*1 |
152,3±3,3*2 |
150,2±4,1*2 |
177,6±3,4*1 |
150,8±3,7*5 |
154,6±4,3*5 |
|
|
4.1. |
72,4±1,6 |
72,2±1,9 |
75,6±1,7 |
74,3±3,3 |
88,9±1,9*1,2 |
78,4±2,0*1,5 |
75,4±1,1*1,5 |
|
|
Паллидин |
116,1±2,3 |
89,8±2,5*1 |
114,1±4,2*2 |
112,5±3,1*2 |
87,1±2,3*1 |
96,7±2,8*1,5 |
117,4±2,1*5,6 |
|
|
4.5. |
96,9±1,5 |
61,6±2,1*1 |
92,0±3,2*2 |
94,2±1,8*2 |
55,5±2,3*1,2 |
93,2±3,0*5 |
95,0±3,5*5 |
|
|
Дематин |
85,1±2,0 |
62,4±1,7*1 |
82,8±3,3*2 |
83,0±2,1*2 |
62,4±2,6*1 |
80,4±2,1*1,5 |
85,5±1,6*5,6 |
|
|
Актин |
94,0±1,5 |
113,2±2,2*1 |
87,4±2,4*1,2 |
85,3±1,4*1,2 |
113,3±2,9*1 |
90,9±1,5*1, 5 |
88,0±1,9*1,5 |
|
|
Г-3-ФД |
45,0±1,0 |
40,7±1,5*1 |
47,6±1,6*2 |
46,4±2,2*2 |
36,7±1,4*1,2 |
43,5±1,5*5 |
43,0±1,6*5 |
|
|
Тропомиозин |
65,6±1,4 |
105,3±1,89*1 |
67,8±2,4*2 |
66,2±1,3*2 |
111,0±2,7*1,2 |
93,3±4,1*1,5 |
82,2±2,4*1,5,6 |
|
|
Г-S-Т |
67,4±1,3 |
66,0±1,6 |
69,9±1,8 |
6,8±2,0 |
54,7±1,5*1,2 |
61,5±2,2*1,5 |
69,6±1,15*5,6 |
|
Примечание: на этой и таблицах 2 и 3 звездочкой отмечены достоверные отличия средних арифметических (p < 0,05); цифры рядом со звездочкой - по отношению к показателям какой группы даны отличия. В этой и таблице 2 единицы измерения показателей – мг%.
При поступлении в стационар у пациентов со II стадией ХИМ выявлены аналогичные изменения содержания белков мембраны эритроцитов, но более выраженные по отношению уровня белка 4.5, Г-3-ФД и тропомиозина. Кроме этого, дополнительно установлено повышение представительности белка 4.1 и снижение Г-S-Т. Проведенная фармакологическая терапия без Глутоксима нормализовала представительность в мембране эритроцитов α-спектрина, АТБ, белка 4.5, актина и Г-3-ФД, изменяла в сторону значений здоровых доноров, но не до их уровня, содержание остальных мембранных белков. Применение Глутоксима дополнительно нормализует содержание β-спектрина, паллидина, дематина, Г-S-Т и корригирует в еще большей степени представительность тропомиозина (табл. 1).
У больных ХИМ I стадии до лечения выявлено снижение в эритроцитарной мембране содержания фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфатидилинозитола (ФИ), глицерофосфолипидов (ГФЛ – сумма ЛФХ, ФХ, ФЭ, ФС и ФИ), сфингомиелина (СМ), фосфолипидов (ФЛ – сумма ГФЛ и СМ), эфиров холестерола (ЭХ), повышение уровня лизофосфатидилхолина (ЛФХ), триацилглицеролов (ТАГ), неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК), при нормальном содержании фосфатидилсерина (ФС), холестерола (Х) и моно- и диацилглицеролов (МАГ, ДАГ). Использование Мексикора нормализовало содержание ФИ и ЭХ, корригировало остальные, измененные до лечения, представители липидов мембраны эритроцитов, но не до уровня контроля. Применение Глутоксима дополнительно нормализует содержание ФЭ, ТАГ, НЭЖК и корригирует представительность ЛФХ (табл. 2).
Таблица 2
Изменения липидного спектра мембраны эритроцитов у пациентов с ХИМ I и II стадии до и после фармакологической терапии (M±m)
|
Показатели |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
|
Здоровые |
ХИМ-1 |
ХИМ-2 |
||||||
|
До лечения
|
После лечения |
До лечения
|
После лечения |
|||||
|
Мексикор |
Мексикор+ Глутоксим |
Мексикор |
Мексикор+ Глутоксим |
|||||
|
ФХ |
20,7±1,0 |
15,1±0,2*1 |
18,1±0,3*1,2 |
17,9±0,4*1,2 |
15,9±0,4*1 |
17,7±0,7*1,5 |
19,3±0,38*5,6 |
|
|
ЛФХ |
6,4±0,4 |
10,5±0,4*1 |
8,5±0,3*1,2 |
7,5±0,2*1-3 |
10,0±0,4*1 |
7,4±0,4*1,5 |
7,7±0,42*1,5 |
|
|
ФЭ |
32,5±0,9 |
26,4±0,5*1 |
29,9±0,4*1,2 |
31,4±0,6*2,3 |
25,5±0,9*1 |
31,7±0,8*5 |
30,8±1,5*5 |
|
|
ФС |
29,0±0,5 |
28,7±0,5 |
29,1±0,5 |
27,9±0,9 |
24,1±0,6*1,2 |
23,3±1,1*1 |
28,0±0,94*5,6 |
|
|
ФИ |
4,4±0,1 |
3,6±0,1*1 |
4,5±0,1*2 |
4,3±0,1*2 |
3,5±0,2*1 |
4,1±0,2*5 |
4,2±0,1*5 |
|
|
ГФЛ |
93,0±1,1 |
84,3±1,3*1 |
90,1±0,9*1,2 |
89,2±1,2*1,2 |
79,0±1,2*1,2 |
84,2±1,3*1,5 |
90,0±1,2*1,5,6 |
|
|
СМ |
13,3±0,4 |
8,7±0,3*1 |
11,8±0,4*1,2 |
10,9±0,5*1,2 |
8,5±0,2*1 |
11,7±0,3*1,5 |
11,7±0,52*1,5 |
|
|
ФЛ |
106,3±1,8 |
93,0±1,3*1 |
101,9±1,7*1,2 |
100,1±1,6*1,2 |
82,5±0,9*1,2 |
92,7±0,9*1,5 |
101,7±2,1*1,5,6 |
|
|
Х |
31,8±1,1 |
32,1±0,6 |
31,3±0,3 |
30,8±1,1 |
40,8±1,2*1,2 |
33,2±1,2*5 |
32,3±0,62*5 |
|
|
ЭХ |
27,1±0,7 |
22,7±0,8*1 |
26,2±0,38*2 |
28,2±1,2*2 |
23,2±0,4*1 |
26,1±1,0*5 |
26,8±0,32*5 |
|
|
ТАГ |
13,0±0,8 |
19,9±0,6*1 |
16,4±0,6*1,2 |
14,3±0,7*2,3 |
20,0±0,6*1 |
16,5±0,9*1,5 |
15,8±0,76*1,5 |
|
|
ДАГ+МАГ |
11,5±0,7 |
11,4±0,3 |
11,2±0,3 |
10,9±0,5 |
11,0±0,3 |
10,9±0,8 |
11,0±0,21 |
|
|
НЭЖК |
3,4±0,1 |
4,5±0,1*1 |
3,8±0,1*1,2 |
3,6±0,1*2 |
4,3±0,2*1 |
3,7±0,2*5 |
3,5±0,1*5 |
|
При поступлении в клинику у пациентов ХИМ II стадии установлены в основном такие же изменения липидного спектра мембраны эритроцитов, но определены и особенности: снижение ФС, повышение Х и более выраженное снижение ГФЛ и ФЛ. Использование Мексикора нормализует в мембране эритроцитов представительность ФЭ, ФИ, Х, ЭХ и НЭЖК, корригирует в сторону контроля содержание остальных исследованных липидов. Включение в фармакологическую терапию Глутоксима, по сравнению с Мексикором, дополнительно нормализует уровень ФХ, ФС и в еще большей степени корригирует содержание ГФЛ и ФЛ (табл. 2).
У больных ХИМ I стадии до начала лечения в эритроцитах установлена активация процессов ПОЛ (повышение концентрации МДА и АГП), снижение факторов антиоксидантной защиты: ОАА, активности СОД и каталазы. Кроме этого, установлено повышение уровня СМON и снижение показателей сорбционной способности мембраны эритроцитов (СЕГ и ССЭ). Включение Мексикора нормализовало СЕГ, активность СОД, каталазы и уровень СМON, в сторону уровня здоровых доноров сдвигалась концентрация продуктов ПОЛ, ОАА и ССЭ. Применение Глутоксима дополнительно нормализовало ОАА и ССЭ и в еще большей степени корригировало уровень продуктов ПОЛ (табл. 3).
Таблица 3
Оксидантные и сорбционные показатели эритроцитов при ХИМ I и II стадии до и после фармакологической терапии (M±m)
|
Показатели |
Единицы измерения |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
|
Здоровые |
ХИМ-1 |
ХИМ-2 |
|||||||
|
До лечения
|
После лечения |
До лечения
|
После лечения |
||||||
|
Мексикор |
Мексикор+ Глутоксим |
Мексикор |
Мексикор+ Глутоксим |
||||||
|
МДА |
ммоль/л |
0,31±0,02 |
1,49±0,07*1 |
0,66±0,04*1,2 |
0,48±0,02*1-3 |
1,7±0,1*1 |
0,44±0,02*1,5 |
0,46±0,03*1,5 |
|
|
АГП |
усл. ед. |
0,18±0,01 |
0,84±0,06*1 |
0,4±0,01*1,2 |
0,28±0,02*1-3 |
0,9±0,03*1 |
0,42±0,02*1,5 |
0,34±0,02*1,5,6 |
|
|
ОАА |
% |
31,1±0,8 |
23,7±0,8*1 |
29,6±0,9*1,2 |
30,8±0,8*2 |
24,8±0,8*1 |
28,4±0,6*1,5 |
31,2±0,8*5,6 |
|
|
СОД |
усл. ед. |
19,2±0,7 |
13,2±0,51 |
20,5±0,6*2 |
20,8±1,2*2 |
13,4±0,5*1 |
19,3±1,0*5 |
20,1±0,5*5 |
|
|
Каталаза |
мкат/л |
9,6±0,3 |
4,8±0,2*1 |
9,5±0,3*2 |
9,7±0,3*2 |
4,9±0,2*1 |
9,7±0,4*5 |
10,4±0,6*5 |
|
|
СМNO |
ммоль/л |
2,3±0,2 |
4,9±0,2*1 |
2,6±0,2*2 |
2,4±0,2*2 |
4,8±0,2*1 |
3,5±0,1*1,5 |
2,9±0,2*1,5,6 |
|
|
СЕГ |
10-12 г/эр. |
1,6±0,1 |
1,0±0,05*1 |
1,7±0,07*2 |
1,5±0,2*2 |
0,96±0,04*1 |
1,6±0,04*5 |
1,5±0,08*5 |
|
|
ССЭ |
% |
32,6±0,8 |
19,6±0,6*1 |
28,2±0,5*1,2 |
31,8±1,4*2,3 |
19,4±0,5*1 |
25,1±0,5*1,5 |
26,3±0,7*1,5 |
|
До лечения у пациентов со II стадией ХИМ в эритроцитах установлено аналогичное изменение всех исследованных параметров. Применение Мексикора нормализовало активность ферментов антиоксидантной защиты и СЕГ, остальные показатели метаболизма эритроцитов сдвигались в сторону уровня здоровых доноров. Включение в фармакологическую терапию Глутоксима дополнительно нормализовало ОАА и корригировало концентрацию АГП и СМON (табл. 3).
Таким образом, из 33 исследованных параметров структурно-функциональных свойств эритроцитов у пациентов с I и II стадией ХИМ до начала лечения оказались измененными от значений здоровых доноров соответственно 84,8% и 97,0% показателей, из которых 69,7% параметров у больных с обеими стадиями ХИМ оказались одинаковыми по величине и по направленности изменений, еще 18,1% идентичны по направленности. Следует отметить, что при нормальных показателях у пациентов I стадии ХИМ, у больных со II стадией белок полосы 4.1 и ФС оказались повышенными, а фракция Г-S-Т снижена, что можно использовать как дополнительные лабораторные параметры для дифференцированной диагностики.
Полученные данные свидетельствуют о том, что уже на ранних стадиях развития ХИМ наблюдаются значительные изменения в содержании белков, ответственных за структурообразование и стабилизацию мембраны эритроцитов (α- и β-спектрин, дематин, анкирин, белок полосы 4.1, паллидин), формообразование и гибкость мембраны (актин, тропомиозин), внутриклеточный метаболизм (анионтранспортный белок, глицеральальдегид-3-фосфатдегидрогеназа, глутатион-S-трансфераза, белок полосы 4.5) [1; 13]. Кроме этого, значительно нарушается и представительность липидного спектра мембран эритроцитов, в первую очередь снижение содержания мембранных глицерофосфолипидов и сфингомиелинов, составляющих основу двойного липидного каркаса клеточной мембраны и играющих основную роль в упорядочивании белковых макромолекул и нормальном метаболизме эритроцитов [4; 14]. Внутриэритроцитарное повышение процессов перекисного окисления липидов и содержания стабильных метаболитов оксида азота, снижение активности ферментов антиоксидантной защиты прями и косвенно свидетельствует о наличии оксидантного стресса [9; 14]. Все выявленные факты приводят к серьезным нарушениям в функциональных свойствах эритроцитов периферической крови уже на ранних стадиях развития ХИМ, что подтверждается в наших исследованиях выраженными нарушениями сорбционных свойств мембраны красных кровяных клеток.
Использование в лечении ХИМ I стадии Мексикора нормализует 53,6% измененных на момент поступления в клинику пациентов лабораторных эритроцитарных параметров и корригирует 46,4%. Более эффективным оказалось включение в комплексную фармакотерапию Глутоксима, так как нормализованы оказались 71,4% и корригированы 28,6% показателей. Применение при II стадии ХИМ Мексикора нормализует 34,4% показателей, измененных до лечения, корригирует 62,5%, без изменений остается 3,1%. Более эффективным, как и при I стадии заболевания, оказалось дополнение фармакологической терапии Глутоксимом, так как нормализованы оказались 59,4%, корригированы 40,6% показателей, характеризующих структурно-функциональные свойства эритроцитов.
Установленные нами корригирующие эффекты использованных препаратов в отношении нарушений структурно-функциональных свойств эритроцитов в первую очередь можно объяснить гипотензивным действием Эналаприла, прямым патогенетическим воздействием Кавинтона, Цераксона и Мексидола на ткани головного мозга с улучшением мозгового кровотока, восстановлением поврежденных мембран клеток через замещение ключевых ультраструктурных компонентов клеточной мембраны (преимущественно ФЛ), ингиброванием действия фосфолипаз и свободных радикалов, нейромедиаторным, антиапоптическом и антигипоксантным действием, активацией аэробного гликолиза и окислительного фосфорилирования [2; 5; 12], что, несомненно, приводит к изменению концентрации и состава нормальных и «патологических» сывороточных белков и липидов, нормализации микроокружения эритроцитов и, таким образом, коррекции уровня и соотношения белков и липидов в мембране красных кровяных клеток. Учитывая патогенетическую роль иммунных нарушений при гипертонической болезни и ХИМ [3] дополнительные выраженные корригирующие эффекты Глутоксима, вероятнее всего, обеспечиваются его избирательным влиянием на функционально-метаболическую активность моноцитов/макрофагов, нейтрофилов, NK-клеток, повышая или снижая их активность в зависимости от исходных значений. Кроме того, препарат оказывает выраженное противовоспалительное, антиоксидантное и регенеративное действие [10]. В то же время нельзя исключить и прямое воздействие данных препаратов на клетки иммунной системы и эритроциты за счет указанных патофизиологических механизмов.
Результаты работы расширяют существующие представления о патогенезе хронической ишемии мозга и являются основой для дальнейшего направленного поиска эффективных средств коррекции нарушений структурно-функциональных свойств эритроцитов, особенно при II стадии заболевания. Перспективным в этом отношении является сочетание других препаратов с антиоксидантным и иммуномодулирующим свойствами [6].