Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Анализ черноморских прибрежных вод последних десятилетий свидетельствует о том, что концентрация кадмия, свинца, меди, цинка и других ионов тяжелых металлов в результате работы промышленных предприятий и сельскохозяйственной деятельности постоянно растет [4, 5]. Особую опасность в этой связи представляют ионы двухвалентного кадмия (Cd²⁺). Опасность ионов Cd²⁺ заключается в том, что их атомный радиус практически полностью совпадает с радиусом ионов двухвалентного кальция (Ca²⁺) [16]. Поэтому кадмий, «маскируясь» под кальций, который является важнейшим регулятором многих внутриклеточных процессов, осуществляет свое разрушающее, токсическое воздействие, вызывает  гибель клеток, тканей и организма в целом. Не менее токсичным воздействием наделены ионы свинца (Pb²⁺), которые быстро аккумулируются в организме и вызывают деструкцию мембран клеток, нарушают работу ферментов, приводят к тканевой дисфункции и в конечном итоге к гибели организма. В этой связи способность осуществлять мониторинг состояния прибрежной морской акватории принадлежит гидробионтам, которые постоянно обитают в этой зоне моря, не совершая миграционных перемещений. В этом отношении выбор оседлых видов моллюсков и малоподвижных рыб является удачным сочетанием, способным объективно отражать состояние среды. Для моллюсков, достаточно толерантных к тяжелым металлам  и способных накапливать их в своих тканях [3, 8, 9], этот период определяется их возрастным статусом. Для оценки состояния прибрежной акватории моря мы  исследовали накопление катионов четырех тяжелых металлов, таких как Cd²⁺, Pb²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, у полуторагодовалых мидий (Mytilus galloprovincialis Lamark) и гигантских устриц (Crassostrea gigas Thunberg), недавно интродуцированных в Черноморском регионе [15].

Для прибрежных рыб, менее толерантных к действию поллютантов, влияние того или иного токсиканта точнее исследовать в экспериментальных условиях, где можно вычленить влияние именно этого фактора, с последующей возможностью экстраполяции полученных результатов на натурные объекты [11]. Для этого мы изучали воздействие Cd²⁺ и Pb²⁺ на проницаемость эритроцитов скорпены для одновалентных катионов Na⁺ и K⁺. Как известно, внутриклеточное содержание K⁺ является важнейшим показателем «благополучия» клетки. Калий в клетке осуществляет поддержание осмотического давления и кислотно-щелочного равновесия; участвует в ферментативных реакциях, т.е. необходим для синтеза протеинов (на 1 г синтезированного протеина требуется 20 мг К⁺), АТФ, гликогена; принимает участие в формировании потенциала покоя, действия, вызывает конформационные перестройки протеинов, способствуя активации ферментов. Калий вместе с натрием участвует в создании на мембране электрохимического потенциала [10]. Поэтому в основные задачи настоящего исследования входило определение содержания некоторых тяжелых металлов в тканях двух видов двухстворчатых моллюсков и исследование перераспределения Na⁺ и K⁺ в эритроцитах придонной костистой рыбы скорпены при воздействии различных концентраций ионов Cd²⁺ и Pb²⁺.

Материал и методы

Объектами исследования были моллюски – средиземноморская мидия (Mytilus galloprovincialis Lamark)  и дальневосточная устрица (Crassostrea gigas Thunberg), а также костистая рыба – скорпена (Scorpaena porcus Linnaeus) – донный малоподвижный, устойчивый к дефициту кислорода вид. Для исследования накопления тяжелых металлов в мягких тканях моллюсков животных в возрасте 1,5 года отбирали с коллекторов, установленных в море на глубине 17–20 м, в зимнее время (декабрь). Рыб отлавливали ставным неводом и дифоном в районе Карадага — восточного побережья Крыма — в весенне-летний (май–июнь) период. Перед опытом рыб в течение суток выдерживали без кормления в бассейнах с проточной морской водой при температуре от +18 до +20^оС.

Исследование накопления тяжелых металлов в мягких тканях моллюсков

Для анализа с коллекторов, выставленных в Карадагской бухте, отбирали по 12 экз. одноразмерных 1,5–2-годовалых животных: мидий весом в 25–30 г и устриц весом в 60–70 г. Навески мягких тканей осушали бумажными фильтрами и доводили при 50–60^оС в термостате до постоянного веса. Определение содержания тяжелых металлов в тканях моллюсков проводили в измерительной лаборатории завода «Море» (пгт. Приморский, г. Феодосия). Содержание тяжелых металлов в мягких тканях моллюсков (мг/кг) определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре AAS–1 (Австрия) в пламени пропан-бутан после обработки проб методом «мокрого» озоления в смеси азотной и хлорной кислот [12].

Приготовление клеточных суспензий эритроцитов скорпены

Пробы крови скорпены получали пункцией хвостовой артерии стеклянной пипеткой и вносили в охлажденную стандартную среду, содержащую гепарин. Эритроциты отделяли центрифугированием (1800 g, 10 мин, 4^оС), надосадочную жидкость и верхний слой клеток удаляли, а оставшиеся клетки промывали этим же раствором трижды. Стандартная среда имела следующий состав в мМ: 180 NaCl, 10 трис-HCl, (pH 7,4 при 20^оС). Суспензию эритроцитов в этой среде (30–40%) сохраняли при 4^оС и использовали в течение 1–2 ч, гематокрит определяли на гематокритной центрифуге.

Определение содержания ионов натрия и калия в эритроцитах скорпены

Для исследования транспорта ионов клетки инкубировали при 20^оС в ультратермостате МК–70 (Германия). Суспензию эритроцитов добавляли к инкубационным средам до конечного гематокрита 1–2%. Стандартная инкубационная среда дополнительно содержала 10 мМ глюкозы. В опытах по воздействию ионов кадмия концентрация CdCl₂ составляла в инкубационной среде 20 мкМ и 200 мкМ, а продолжительность инкубации клеток — 2 ч. Концентрация Pb(NO₃)₂ в инкубационной среде составляла 1, 2, 5, 10, 20 и 50 мкМ, время инкубации — 20 мин. После инкубации клеточную суспензию центрифугировали (1800g, 1 мин, 4^оС), среду удаляли, эритроциты дважды промывали холодным отмывочным раствором. Отмывочный раствор имел следующий состав, мМ: 120 MgCl₂, 10 трис-HCl (pH 7,4 при 4^оС). Отмытые клетки лизировали бидистиллированной водой, в лизатах определяли концентрацию ионов калия и натрия на пламенном фотометре. Концентрацию ионов рассчитывали в ммоль на 1 литр упакованных клеток (ммоль/л).

Все полученные данные обработаны статистически и представлены в виде средней ± стандартная ошибка [14].

Результаты и обсуждение

Содержание тяжелых металлов в мягких тканях гигантской устрицы и средиземноморской мидии

Мидии и устрицы по способу питания являются активными фильтраторами. Как и другие двустворчатые моллюски, они питаются взвешенным в толще воды детритом (мельчайшими остатками отмерших растений и животных) и микропланктоном (одноклеточными водорослями, бактериями и очень мелкими животными). Двустворчатые моллюски профильтровывают очень большие объемы воды. Так, гигантская устрица массой в 60 г может профильтровать за 1 ч около 10 л воды, или 87,6 м³ в год [7]. За год одна мидия массой в 2 г при средней концентрации взвеси 5 мг/л-1 профильтровывает 2,8 м³, массой в 10 г – 5,8 м³ и весом в 30 г – 9,8 м³ воды. Образуя плотные скопления на прибрежных камнях (банках), мидии и устрицы  могут профильтровать за сутки от 50 до 280 м³ воды на 1 м² популяции [17]. Таким образом, большие поселения моллюсков представляют собой мощный биофильтр, всасывающий из окружающей воды большое количество взвеси, как минеральной, так и органической [18]. Мидии и устрицы являются перспективными объектами прибрежной марикультуры [15]. В этой связи исследование содержания тяжелых металлов в мягких тканях этих видов моллюсков имело вполне прикладной аспект. Изучение содержания тяжелых металлов осуществлялось в мягких тканях 1,5–2-летних мидий и устриц, взятых с коллекторов в зимний период. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Содержание тяжелых металлов в мягких тканях мидий (M. galloprovincialis) и дальневосточной устрицы (С. gigas) (в мг/кг сырого веса ткани), находящихся на коллекторах в море

Примечание: * — предельно допустимые концентрации (ПДК) в морской воде для тяжелых металлов по ГОСТ – 26931-86; число исследованных животных в каждой серии опытов составляло 10–12 особей.

Полученные результаты показали, что содержание свинца и кадмия в тканях исследованных видов было незначительным и много ниже установленных уровней ПДК. Как известно, мидии относятся к организмам, способным быстро и в больших количествах накапливать кадмий и другие тяжелые металлы. Так, было показано, что 3-суточное содержание беломорской мидии (Mytilus edulis) в аквариумах с 500 мкг/л CdCl₂ приводило к 30-кратному увеличению концентрации поллютанта в мягких тканях моллюска [3]. Поэтому полученные нами результаты по содержанию этих тяжелых металлов в тканях моллюсков свидетельствовали об относительной чистоте среды их обитания. Кроме того, в наших исследованиях был получен  результат значительного накопления устрицами меди и цинка. Так, в тканях устрицы содержание меди в 2,6 раза превышало установленную ГОСТом ПДК и было выше в 2000 раз, чем  в тканях мидии. Концентрация цинка у устриц практически совпадала с ПДК и была на порядок выше, чем содержание этого элемента в мягких тканях исследованных мидий (табл. 1). 

Ранее было показано, что устрицы по сравнению с мидиями имеют высокую эффективность ассимиляции и медленное выведение из организма металлов [21]. Возможно, этим и объясняются различия в содержании этих металлов в исследуемых моллюсках. Кроме этого, устрицы уже давно известны как медийно-цинковые концентраторы, способные в норме накапливать огромные количества этих металлов [2]. Наши данные по содержанию цинка сопоставимы с данными, полученными по накоплению этого металла гигантскими устрицами из Амурского залива, которое составило 875–1262 мг/ кг сухого веса ткани [8]. Диапазон концентрации меди в устрицах из Уссурийского залива колебался в пределах 79–135 мг/кг сухого веса ткани [9], что также соответствовало нашим результатам по накоплению этого поллютанта в тканях моллюска. Причины столь высокой избирательности накопления цинка и меди в тканях моллюсков неясны. На наш взгляд, существенное различие по содержанию меди и цинка в тканях исследованных моллюсков кроется в различной «востребованности» этими видами указанных двухвалентных ионов. Медь и цинк входят в металлопротеиновые комплексы большого числа ферментов и белков гемолимфы. Возможно, потребности в этих металлах можно связать также с высокой репродуктивной способностью моллюсков. Так, одна женская особь C. gigas во время нереста способна выметать в среду за несколько часов до 100 млн яйцеклеток, а одна мужская – до 500 млн сперматозоидов. Плодовитость мидий тоже достаточно велика и оценивается в несколько миллионов яйцеклеток за один нерестовый цикл [7]. Как мы полагаем, накопление меди и цинка у устриц и цинка у мидий обусловлено биохимическими потребностями их организма.

Таким образом, несмотря на ухудшение состояния морской среды, в районе Карадага полученное нами низкое накопление кадмия и свинца (табл. 1) мидиями и устрицами (с учетом их высокой способности к накоплению меди и цинка) не свидетельствует о драматическом характере загрязнений прибрежной акватории заповедника. Эти показатели могут быть надежными тестами в пользу развития в регионе марикультурных хозяйств.

Рис. 1. Снижение концентрации K⁺ в эритроцитах под влиянием Cd²⁺. Цифры внутри столбиков показывают число измерений. Все величины, полученные в присутствии Cd²⁺, достоверно отличаются от контроля (p < 0,01). Влияние Cd²⁺ и Pb²⁺ на транспорт Na⁺ и K⁺ в эритроцитах скорпены

В отмытых эритроцитах скорпены перед инкубацией выявились высокое содержание ионов K⁺ (102 ± 2,5 ммоль/л клеток) и низкая концентрация Na⁺ (8,9 ± 1,9 ммоль/л клеток). По ионному составу эритроциты скорпены не отличались существенно от красных клеток крови человека [13]. В серии экспериментов по влиянию Cd²⁺ на транспорт ионов через мембрану эритроцитов скорпены оценивали после двухчасовой инкубации в средах, содержащих 20 мкМ и 200 мкМ токсиканта (рис. 1).

Как видно из представленных данных, Cd²⁺ значительно стимулировал потерю K⁺ из эритроцитов. На эритроцитах человека показано, что Cd²⁺ может транспортироваться внутрь клетки, но данные о нарушении транспорта одновалентных катионов отсутствуют [20]. Снижение внутриклеточной концентрации K⁺ после 2-часовой инкубации эритроцитов скорпены в среде с Cd²⁺ было значительным. При концентрации Cd²⁺ в 20 мкМ это падение составляло 19% от исходного уровня, а при концентрации Cd²⁺ в 200 мкМ – 28% (рис. 1). Однако остается не ясным, является ли этот вход открытием специфического ионного канала или обусловлен общим увеличением проницаемости мембраны для К⁺, вызванным деструктивными действиями Cd²⁺. Вход Na⁺ в эритроциты под действием токсического стресса не был значимым при 20 мкМ Cd²⁺ (14,6 ± 1,8 ммоль/л клеток), а при 200 мкМ Cd²⁺ — достоверно более высоким по сравнению с контролем (20,9 ± 1,9 ммоль/л клеток).

Рис. 2. Снижение концентрации K⁺ в эритроцитах под влиянием Pb²⁺. Цифры внутри столбиков показывают число измерений. Все величины, полученные в присутствии Pb²⁺, достоверно отличаются от контроля (p < 0,01)

Действие ионов Pb²⁺ на выход K⁺ из эритроцитов скорпены сходно c действием ионов Cd²⁺ (рис. 2). Как показали исследования на эритроцитах человека, выход ионов K⁺ обусловлен способностью ионов Pb²⁺ вызывать в плазматических мембранах активизацию K⁺-каналов [22]. В отношении механизма действия ионов Pb²⁺ на мембрану эритроцитов рыб данные практически отсутствуют. Мы предприняли попытку выявить эту способность на эритроцитах скорпены. Эритроциты скорпены инкубировали в стандартной среде, не содержащей Ca²⁺, в присутствии различных концентраций Pb²⁺ в течение 20 мин при 20–22^oC. Как видно из рисунка 2, инкубация эритроцитов в средах с низкими концентрациями Pb²⁺ (1 и 2 мкМ) сопровождалась статистически значимым уменьшением содержания K⁺ в клетках (в среднем на 17%). При дальнейшем повышении концентрации Pb²⁺ в среде потери клетками ионов K⁺ существенно возрастали, достигая 75% от содержания K⁺ в необработанных эритроцитах. Как и в случае с Cd²⁺, наблюдали относительно небольшое увеличение внутриклеточной концентрации Na⁺ при обработке эритроцитов скорпены 5–50 мкМ Pb²⁺. По сравнению с контрольным уровнем (в этой серии опытов, равной 21,0 ± 5,2 ммоль/л клеток) содержание Na⁺ возрастало до 25,0 ± 2,1 и 37,2 ± 5,2 ммоль/л клеток в присутствии 5 и 50 мкМ Pb²⁺ соответственно. Прирост содержания Na⁺ в эритроцитах составлял только 15% от потерь внеклеточного K⁺, и суммарное содержание обоих катионов уменьшалось приблизительно на 50% после 20 мин инкубации клеток в присутствии Pb²⁺. Прямым доказательством открытия ионами Pb²⁺ в эритроцитах скорпены K⁺-каналов было использование блокатора этих каналов – хинидина. Хинидин в концентрации 1 мМ полностью блокировал вызываемый ионами Pb²⁺ выход ионов K⁺ из эритроцитов скорпены. Полученные нами данные свидетельствуют, что активация K⁺-каналов ионами Pb²⁺ происходит в концентрационном диапазоне (1–50 мкМ), близком для эритроцитов человека [19]. Механизм индуцирования каналов остается неясным, хотя нами предполагается, что ионы Pb²⁺ участвуют в их образовании, т.е. можно говорить о Pb²⁺-активируемых K⁺-каналах. По всей вероятности, образование Pb²⁺-активируемых K⁺-каналов происходит после проникновения Pb²⁺ в эритроциты. Известно, что вход Pb²⁺ в эритроциты человека происходит через анион-транспортные пути в виде отрицательно заряженных комплексов [23]. Возможно, аналогичным образом это происходит и в эритроцитах скорпены, хотя для более точного подтверждения требуются дополнительные исследования.

Способность Cd²⁺ и Pb²⁺ вызывать значительные потери K⁺ эритроцитами имеет далеко идущие последствия, связанные с их морфофункциональными изменениями. Потеря эритроцитами таких количеств K⁺ может вызывать уменьшение объема клетки, гиперполяризацию мембраны и сдвиг внутриклеточного pH. Исследования на эритроцитах крыс показали, что Cd²⁺ вызывал снижение диаметра, периметра и площади клеток; увеличение их фазовой высоты, микроцитоз, увеличение интенсивности перекисного окисления липидов и кислотной резистентности клеток; эхиноцитоз и снижение деформируемости клеток, т.е. типичные признаки развития токсической анемии [6]. В эритроцитах сеголеток карпа под действием Cd²⁺ и Pb²⁺ происходят уменьшение гемоглобина и эритроцитов в целом, снижение их кислотной резистентности и нарастание анемии [1]. Эти исследования и наши наблюдения убедительно свидетельствуют, что эритроциты рыб могут быть использованы как надежные тест-системы для выявления токсического воздействия тяжелых металлов при мониторинге прибрежной акватории моря.

Заключение

В результате проведенных исследований показано, что превышение уровня (ПДК) Cu²⁺ и Zn²⁺ в мягких тканях дальневосточной устрицы не может служить биоиндикатором состояния качества морской среды вследствие накопления этих элементов, обусловленных биохимическими потребностями существования данного вида. Напротив, накопления по кадмию и свинцу  у моллюсков могут быть хорошими биомаркерами, которые показали относительную чистоту прибрежной акватории Карадагского заповедника. Эти показатели являются весомыми аргументами в пользу развития в регионе марикультурных хозяйств.

Наши наблюдения и работы других исследователей [19, 22, 23] убедительно свидетельствуют о том, что перераспределение Na⁺ и K⁺ в эритроцитах рыб  может быть использовано как надежный биоиндикатор для выявления токсического воздействия тяжелых металлов при мониторинге прибрежной акватории моря.