Заразиха подсолнечная (Orobanche сumana Wallr.) представлена многочисленными расами, постоянно возникающими в результате сопряженной эволюции паразита и хозяина, которые способны преодолевать иммунитет устойчивых генотипов. В последнее время на юге России сотрудниками ВНИИ масличных культур дифференцировано 8 рас O. cumana: A, B, C, D, E, F, G, H [1; 3; 4]. Угроза снижения урожаев подсолнечника вследствие быстрого распространения новых рас заразихи на юге РФ актуализировала направление селекции подсолнечника на создание устойчивых генотипов к этому растению-паразиту.
Внедрение молекулярных маркеров в современные селекционные программы позволяет многократно повысить эффективность отбора перспективных образцов, в том числе устойчивых к патогенам [10; 11].
Целью работы является поиск информативных ДНК-маркеров устойчивости подсолнечника к заразихе.
Материалы и методы
На инфекционном фоне в оранжерее Донской опытной станции им. Л.А. Жданова ВНИИ масличных культур были выделены образцы, контрастно различающиеся по устойчивости/чувствительности к наиболее вирулентным в Ростовской области расам заразихи O. cumana (табл. 1). Для создания инфекционного фона использовали смесь семян заразихи, собранных в различных районах и агроклиматических зонах Ростовской области. Поражаемость оценивали по наличию проростков заразихи на корнях исследуемых образцов. В работе использовали 18 RAPD-маркеров: P36, P37, P38, P46, P53, OPT-08, OPW-04, OPW-06, OPW-09, OPW-10, OPW-15, OPX-01, UBC-73, UBC-120, UBC-264, UBC-318, UBC-685, OPA-17 [7]; 11 SSR-маркеров: ORS 1222, ORS 1114, ORS 1036, ORS 1056, ORS 1040, ORS 202, ORS 1112, ORS665, ORS 1021, ORS 718, ORS 545 [12] и 9 SCAR-маркеров: RTS05, RTS 05_1, RTS 28, RTS 29, RTS 29_1, RTS40, RTS40_1, RTS 41, RTS 43 [8], ассоциированных, по данным литературы, с устойчивостью подсолнечника к O. cumana.
Таблица 1
Образцы подсолнечника, исследованные на наличие ДНК-маркеров устойчивости к заразихе
|
№ пробы |
Генотипы, устойчивые к заразихе |
№ пробы |
Генотипы, не устойчивые к заразихе |
|
1 |
J-2/2979 |
22 |
С-1/98 |
|
2 |
C-1/87 |
23 |
С-1/132 |
|
3 |
C-1/144 |
24 |
J-2/4341 |
|
4 |
J-3/2822 |
25 |
Донской 22 |
|
5 |
J-3/2825 |
26 |
J-2/4412 |
|
6 |
J-4/495 |
27 |
J-5/169 |
|
7 |
J-4/501 |
28 |
J-5/931 |
|
8 |
J-4/507 |
29 |
J-5/236 |
|
9 |
J-4/509 |
30 |
J-5/1448 |
|
10 |
J-4/517 |
31 |
J-4/169 |
|
11 |
J-4/525 |
32 |
J-4/931 |
|
12 |
J-3/2849 |
33 |
J-4/236 |
|
13 |
J-4/541 |
34 |
J-5/73 |
|
14 |
J-4/546 |
35 |
J-5/383 |
|
15 |
J-3/3136 |
36 |
J-5/869 |
|
16 |
J-4/746 |
37 |
J-5/169 |
|
17 |
J-4/756 |
38 |
J-5/931 |
|
18 |
J-4/759 |
39 |
J-3/236 |
|
19 |
J-2/4402 |
40 |
J-3/73 |
|
20 |
J-2/4405 |
41 |
J-3/45 |
|
21 |
J-2/4417 |
|
|
Геномную ДНК выделяли из высечки листовой ткани сорбентным методом [9]. Полимеразную цепную реакцию проводили согласно [2]. Реакцию амплификации проводили в термоциклере Palm-Cycler (Corbett Research, Австралия) по следующей программе для RAPD анализа: 1) один цикл: 4 мин. 94 °С; 30 циклов: 1 мин. 94 °С, 1 мин. 37 °С, 1 мин. 72°С; один цикл: 10 мин. 72 °С; для SSR- и SCAR-анализа 1) один цикл: 4 мин. 94 °С; 35 циклов: 1 мин. 94 °С, 1 мин. 60 °С, 1 мин. 72°С; один цикл: 10 мин. 72 °С. Очистку фрагментов амплифицированной ДНК для прямого секвенирования выполняли согласно [13]. Нуклеотидные последовательности определяли с использованием набора реагентов ABI Prism BigDye Terminator v.3.1.(«Applied Biosystems», USA) согласно прилагаемой инструкции с последующим анализом продуктов на секвенаторе ABI Prism 3130xl. Хромотограммы анализировали с помощью пакета программ BioEdit 7.0.9.0. [6].
Для дизайна праймеров использовали программу Primer Quest Tool от Integrated DNA Technologies, Inc.
Результаты
Среди исследованных 18-ти RAPD маркеров, специфичных для устойчивых образцов не обнаружено, однако два маркера - OPA17_1800 и UBC685_1500, были амплифицированы у 81% чувствительных образцов. Интересно отметить, что RAPD маркер UBC120_660, описанный в работе [8], как ассоциированный с устойчивостью к заразихе, оказался не информативным в нашей выборке генотипов. Остальные маркеры также оказались неинформативными для кластеризации генотипов по признаку устойчивости/чувствительности к патогену.
Результаты амплификация ДНК изучаемых образцов с 11 SSR-праймерами показали, что электрофоретические профили существенно отличаются друг от друга, однако они также не коррелировали с устойчивостью подсолнечника к заразихе.
Из 9 SCAR-маркеров, только два - RTS 40 и RTS 40_1, позволили кластеризовать исследуемые генотипы. На электрофореграммах у всех устойчивых образцов отсутствовали бэнды размером около 360 п.н. (маркер RTS 40) и 300 п.н. (маркер RST 40_1), которые были характерны для неустойчивого к заразихе подсолнечника.
В дальнейшем мы провели секвенирование этих двух ампликонов, последовательности нуклеотидов которых приведены в таблице 2.
Таблица 2
Последовательности нуклеотидов ДНК фрагментов
|
ДНК-маркеры |
Последовательность нуклеотидов |
|
RTS 40 |
ACAATGGCCGCCGAAGCCCACTGCGGTAACCCGGTTCGGCTCGGTTTCGAACTGACGATCTCCAAAGAGGCCTAGTTCTAAACTTCATTGCCACCACCAATGTCCTTCAAAGTGATGCTAGTGGGAGTAAACCCCTAATGTGAGCTCGACAATAGCTTGAAAATTGTAATCATAACTAAGCTTGATGAAATAACTCGGATTTAAAAGCTTTAATGGCTTGATATGTCTAGTAGAGTTTCGTTGATAAAATGGCCCAAAATATATGTTCAAATCGCTCGTCGCTTATCGCTCGCTCGCCGATCGTTCGGAAAACGCTCGGAATATGTCCGCTCGGTGGAA |
|
RTS 40_1 |
GGCATTTTTATCACGAAACTCTACTAGACATATCAAGCCATTAAAGCTTTTAATCCGAGTTATTTCATCAAGCTTAGTTATGATTACAATTTTCAAGCTATTGTCGAGCTCACATTAGGGGTTTACTCCCACTAGCATCACTTTGAAGGACATTGGTGGTGGCAATGAAGTTTAGAACTAGGCCTCTTTGGAGATCGTCAGTTCGAAACCGAGCCGAACCGGGTTTTACCGCAGTGGGCCTTCGGGCGGCGGGTTTTCTCCGGAACTGGTAGCTCA |
Данные последовательности были проанализированы с помощью программы Blast в GenBank NCBI. Оказалось, что нуклеотидные последовательности фрагмента ДНК, амплифицированного с праймером RTS 40 на 98%, а с праймером RTS 40_1 на 81% гомологичны последовательности № HQ222362.1 в GenBank [5], в которой расположены гены NBS-LRR, контролирующие устойчивость подсолнечника к комплексу патогенов.
Исходя из полученных результатов, был расширен поиск маркеров, ассоциированных с устойчивостью к заразихе, и определены 11 новых маркеров генов NBS-LRR и межгенных регионов локуса № HQ222362.1. Для идентификации этих маркеров нами были разработаны новые праймеры (табл. 3).
Таблица 3
Праймеры для идентификации генов NBS-LRR и межгенных регионов
|
№ |
Локус |
Последовательность оснований (5'-3') |
Размер, п.н. |
Тm, 0С |
GenBank |
|
1 |
Zar1 |
GCATCACTTTGAAGGACATTGG ATGCGTTGTGTAATTCTTGTATGG |
529 |
60 |
HQ222362.1 |
|
2 |
Zar2 |
CCAACTCTGACCGTTATGAAGA GCGATGTCTAGTTGTTTGGTTG |
437 |
60 |
HQ222362.1 |
|
3 |
Zar3 |
TATGGAGGATCTGGTCGGTTAG GAAAGTGGTTGTGAGTGAAGGA |
716 |
60 |
HQ222362.1 |
|
4 |
Zar4 |
CAACCATGCACTCCCAATTTAC GTTGCCCAACAACTTCCTAATG |
990 |
60 |
HQ222362.1 |
|
5 |
Zar5 |
TAAACAAGAAGCAAGGCATCAAG GTGCTCTATCGAACGGGAATAA |
317 |
60 |
HQ222362.1 |
|
6 |
Zar6 |
TGGGTAATCTCCTACTACCCTAAA GAATGCCAAGTTCTTCTCGAATG |
301 |
60 |
HQ222362.1 |
|
7 |
Zar7 |
CGAACAACTGGTGTGCATTT GTGTTGCCACTGCAAGTTATG |
356 |
60 |
HQ222362.1 |
|
8 |
Zar8 |
CCCAACGTCTCAACGTTATCT GGGAGAAATGGGCAAACAATAC |
568 |
60 |
HQ222362.1 EU924141.1 |
|
9 |
Zar9 |
ACATGCCTTTCTGTGAATGGA GAGTTCAGGATCTGGGATTTGG |
206 |
60 |
HQ222362.1 |
|
10 |
Zar10 |
CCAACCCAAATGACCAAGAATAG CTGATGCCCGAGAGTCTTTAC |
234 |
60 |
HQ222362.1 |
|
11 |
Zar11 |
GCAGTGAGGACGGTTGTTAG AAGCAGAACAATGATGGACAAATC |
200 |
60 |
HQ222362.1 |
Из 11 маркеров только два – Zar1 и Zar2, оказались информативными для идентификации генотипов, устойчивых к заразихе. Так, у 90% устойчивых форм наблюдается амплификация фрагментов 529 и 437 п.н., отсутствующих у поражаемых образцов.
Выводы
С помощью 18 RAPD-, 11 SSR- и 9 SCAR-маркеров, которые, по данным литературы, ассоциированы с устойчивостью подсолнечника к заразихе, были генотипированы образцы Донской опытной станции ВНИИМК, контрастно различающиеся по устойчивости/чувствительности к наиболее вирулентным в Ростовской области расам. Ни один из этих маркеров не был специфичным для устойчивой группы генотипов. Однако два RAPD-маркера - OPA17_1800; UBC685_1500 и два SCAR-маркера - RTS 40; RTS 40_1 были характерны для неустойчивых к заразихе образцов.
Прямое секвенирование и поиск гомологии в GenBank NCBI маркеров - RTS 40 и RTS 40_1, позволил найти последовательность семейства генов NBS-LRR, контролирующих устойчивость подсолнечника к комплексу патогенов. Используя последовательность локуса NBS-LRR (№ HQ222362.1, GenBank NCBI), были определены 11 новых маркеров генов и межгенных регионов. Среди них два маркера - Zar1 и Zar2 - оказались информативными для идентификации генотипов, резистентных к заразихе. Эти маркеры могут представлять непосредственный интерес в селекции подсолнечника.