Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

RESULTS OF AGONISTS PPARγ AND PPARa IN MODEL OXYGEN-INDUCED RETINOPATHY

Gavrilova N.A. 1 Gadzhieva N.S. 1 Komova O.Y. 1 Karamysheva E.I. 1
1 Moscow State University of Medicine and Dentistry n. a. A. I. Evdokimov
Currently most important medical and social problem in ophthalmology is pathology retina associated with neovascularization, which leads to a significant reduction in vision, blindness and disability. Results of studies in recent years show that PPARs can be therapeutic target in the pathology associated with the formation of neovascularization. In an experimental model of oxygen-induced retinopathy were analyzed the effectiveness of pioglitazone and fenofibrat composition. It is found that by using of fenofibrat in the form of eye drops in animals with oxygen-induced retinopathy in the retina retained higher levels of membrane proteins of tight junctions (p <0.05); by using intravitreal pioglitazone and fenofibrat in the form of eye drops decreased the level of TNF-α, ICAM-1 and VEGF, reduced the area of retinal neovascularization. (p <0.05)
oссludin
retinal neovascularization
oxygen-induced retinopathy
blood-retinal barrier
retina
claudin -1
claudin-2
claudin-5
vegf
tnf-α
ICAM-1

В настоящее время одной из важнейших медико-социальных проблем в офтальмологии является патология сетчатки, связанная с неоваскуляризацией, которая приводит к значительному снижению зрения, слепоте и инвалидности. При разработке современных антиангиогенных стратегий терапевтической мишенью на сегодняшний день в основном является эндотелиальный сосудистый фактор роста (Vascular Endothelial Growth Factor - VEGF) [20; 22]. В связи с многофакторностью патогенетического механизма формирования патологического ангиогенеза анти-VEGF терапия, блокирующая биологическое действие VEGF, не всегда бывает эффективной. Результаты исследований последних лет свидетельствуют, что еще одной из возможных терапевтических мишеней при патологии, связанной с формированием неоваскуляризации, могут являться PPARs.

PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) - ядерные рецепторы, активируемые пероксисомным пролифератором и регулирующие экспрессию генов. Идентифицировано 3 изоформы PPARs: альфа, гамма и дельта (бета) с различным числом аминокислотных остатков, обладающих различными функциями [3]. Экспрессируются PPARs в тканях с высоким уровнем митохондриального окисления жирных кислот - в печени, почках, сердце, скелетных мышцах и сетчатке, присутствуют в моноцитах, макрофагах и эндотелиальных клетках [3; 6; 7; 17]. В сетчатке PPARs интенсивно экспрессируются во всех слоях [12], только в клетках пигментного эпителия выявлены представители всех типов PPARs - PPARа, PPARβ/б1, PPARβ/б2, PPARγ1 и PPARγ2 [9].

При экспрессии в эндотелиальных клетках PPARα, PPARβ/δ и PPARγ регулируют процессы клеточной пролиферации, ангиогенеза, адгезии, агрегации и воспаления. PPARα и PPARγ обладают преимущественно антиангиогенными свойствами (увеличивают экспрессию антиангиогенных и ингибируют экспрессию проангиогенных факторов). PPAR β/δ обладают проангиогенными свойствами, участвуют в процессах клеточной пролиферации, ангиогенеза и воспаления [4].

К PPAR-α-агонистам относятся препараты фармакологической группы фибраты - Фенофибрат, Трайкор и др. с основным механизмом действия гиполипидемическим.

Установлено, что в результате активации PPAR-α с помощью PPAR-α-агонистов блокируется VEGF-индуцированная пролиферация эндотелиальных клеток пупочной вены человека за счет снижения экспрессии VEGFR2 - рецептора VEGF [19].

При активации PPAR-α блокируется VEGF-индуцированная неоваскуляризация роговицы за счет повышения продукции антиангиогенных факторов (тромбоспондин-1, эндостатин) и ингибирования фактора роста фибробластов, обладающих проангиогенными свойствами [23].

При культивировании клеток пигментного эпителия сетчатки с добавлением фенофиброевой кислоты значительно снижается индуцированное нарушение плотности клеточного монослоя и, соответственно, его гиперпроницаемость [26; 27]. Wang S. с соавт. [29] было установлено, что при культивировании клеток пигментного эпителия в условиях высокой концентрации глюкозы и гипоксии снижается экспрессия генов окклюдина и клаудина-1. Однако результаты перечисленных работ свидетельствуют о возможности предотвращения нарушения проницаемости только внешнего гематоретинального барьера.

В исследовании Lu B. с соавт. [18] было установлено, что при использовании фенофибрата в инстилляциях его концентрация и концентрация его активного метаболита - фенофиброевой кислоты, активирующей рецепторы PPARα, была значительно выше, чем при пероральном применении. Авторами было также установлено, что применение фенофибрата в инстилляциях является безопасным и эффективным. Роговица остается прозрачной, слезная пленка сохраняет свои физико-химические свойства, активность апоптоза в клетках сетчатки не отличается от контроля. Установлено, что при инстилляциях фенофибрата в течение 4 недель у крыс со стрептозотоциновым диабетом достоверно ниже уровень лейкостаза в сосудах сетчатки и их проницаемость. В результате проведения клинических исследований было выявлено, что при использовании фенофибрата - агониста экспрессии PPARa течение диабетической ретинопатии носит более благоприятный характер [8; 15].

Определенный интерес на сегодняшний день представляет препарат пиоглитазон из группы тиазолидиндионов (глитазонов) - селективных агонистов ядерных рецепторов PPARγ с гипогликемическим и гиполипидемическим фармакологическим механизмом действия, используется при сахарном диабете 2 типа.

На экспериментальной модели индуцированной хориоидальной неоваскуляризации выявлено, что пиоглитазон, активируя экспрессию PPARγ в сетчатке животных, блокирует проангиогенные эффекты bFGF (фактора роста фибробластов) и предотвращает активное формирование неоваскуляризации [1]. При применении пиоглитазона на модели кислород-индуцированной ретинопатии было выявлено, что уменьшаются площадь неоваскуляризации и площадь облитерированных сосудов сетчатки и увеличивается площадь физиологической васкуляризации [13].

При индуцированном подавлении экспрессии PPARγ в сетчатке, развивающейся у животных с экспериментальным диабетом и кислород-индуцированной ретинопатией, наоборот, нарушается барьерная функция эндотелия и активно начинает формироваться неоваскуляризация [25; 28].

Кроме того, PPARγ обладают нейропротективным действием, предотвращая накопление жирных кислот в сетчатке [10]. При активации PPARγ повышается экспрессия и активируются ферменты антиоксидантной системы - супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы [5]. При диабетической ретинопатии пиоглитазон корригирует дисбаланс между NO и эндотелином [16; 21; 24].

Однако данный препарат пациентам с сахарным диабетом 2 типа рекомендуется назначать с осторожностью в связи с возможностью формирования отечного синдрома. По результатам исследования одних авторов, макулярный отек в группах пациентов с сахарным диабетом 2 типа, использующих тиазолидиндионы в комплексном лечении, развивается в 1,3%, не использующих тиазолидиндионы - в 0,2% случаев [11; 14]. По результатам другого исследования, наличие связи между макулярным отеком у пациентов с сахарным диабетом 2 типа и применением тиазолидиндионов выявлено не было [2].

Полученные результаты позволяют предположить, что данные препараты могут быть реальными претендентами на роль ингибиторов неоангиогенеза в офтальмологии. Для подтверждения этого предположения необходимо провести более детальные, всесторонние исследования.

Цель исследования

На экспериментальной модели кислород-индуцированной ретинопатии провести анализ эффективности применения фенофибратной композиции и пиоглитазона.

Материал и методы исследования

Работа проведена на 60 крысах (120 глаз) линии albino Wistar, выращенных в питомнике лабораторных животных «Столбовая» Российской академии медицинских наук. Исследования проводились в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (National Academy press, 1996).

Экспериментальная модель кислород-индуцированной ретинопатии

С 7-го по 12-й день жизни животные вместе с кормящими матерями находились в условиях гипероксии - в инкубаторе, подключенном к кислородному концентратору Atmung 5L-I с непрерывной подачей 100%-ного кислорода под давлением (насыщенность кислорода в инкубаторе составляла 75±5%). Для предотвращения формирования респираторного дистресс-синдрома у самок производилась их замена; с этой целью для подкорма и проведения очистительных работ инкубатор ежедневно открывался не более чем на 5 минут. В комнатные условия - условия относительной гипоксии (содержание кислорода 21%) - животные переводились на 12-е сутки.

Инстилляции фенофибратной композиции (фенофибрат, натрия лаурилсульфат, гиалуроновая кислота и дрю, рН = 6,7) производили в течение 5 дней (12-17-й день жизни животного), четыре раза в день, в контроле использовали аналогичную композицию без фенофибрата. Режим закапывания был определен в связи с данными, полученными Lu B. с соавт. [18]: максимальная концентрация фенофиброевой кислоты - активного метаболита фенофибрата в сетчатке авторами была зарегистрирована в интервале времени 4-6 часов после закапывания, через 12 часов ее концентрация была минимальной.

Пиоглитазон 0,2 мкл (100 мкмоль/л) растворяли в 0,1%-ном диметилсульфоксиде (ДМСО) и вводили интравитреально на 12-е сутки жизни, в контроле вводили 0,1% ДМСО без пиоглитазона.

Анализ уровня содержания ФНО-α, ICAM-1 и VEGF проводился на 15-е и 18-е постнатальные сутки, уровня содержания мембранных белков плотных контактов и площади ретинальной неоваскуляризации - на 18-е сутки; в каждую из 4 опытных групп - применение фенофибратной композиции, пиоглитазона, комбинированного их применения и ранибизумаба, группу экспериментальных и интактных животных было включено 10 животных, по 5 животных на каждый день исследования (15-е и 18-е сутки).

Для проведения исследования животные были подвергнуты эвтаназии согласно требованиям «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей» (Страсбург, 1986). Энуклеация проводилась по стандартному протоколу.

Для определения содержания белков клеточных контактов – окклюдина, клаудина -1, -2 и -5 проводили Вестерн-блот анализ с использованием крысиных антител (Zymed Laboratories, США) к белкам плотных контактов, клаудину-5 (1:5000), окклюдину и клаудину-1 (1:2000) и клаудину-2 (1:1000). Денситометрический анализ Вестерн-блот сигналов проводили с использованием программного обеспечения ImageJ.

Определение уровней содержания ФНО-α, ICAM1 и VEGF и в гомогенатах сетчатки проводилось иммуноферментным методом с использованием наборов Rat TNF-alpha ELISA kit, Rat ICAM1 ELISA kit, Rat VEGF DuoSet ELISA kit, фирмы R&D Systems, Inc., USA, в соответствии с инструкциями изготовителя. Общую концентрацию белка в гомогенатах сетчатки определяли с помощью анализа Брэдфорда.

Методика приготовления и исследования тотальных препаратов сетчатки

После энуклеации глаза препарировали под бинокулярным микроскопом. Извлеченную сетчатку фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида в течение суток при температуре +4 °C. После тщательной промывки в фосфатном буфере сетчатку погружали в раствор биотинилированного изолектина B4 Griffonia simplicifolia (Vector Laboratories, США) в разведении 1:100 в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) pH 7,2-7,4 в течение 12 часов при +4 оС. В дальнейшем сетчатку погружали в раствор стрептавидина, конъюгированного с флуоресцентными красителями Cy3 или FITC (Jackson ImmunoResearch, Великобритания) на 1 час при комнатной температуре для визуализации сосудистой сети. После трехкратной промывки в фосфатном буфере сетчатку помещали на предметное стекло, покрывали глицерином и покровным стеклом.

Компьютерный анализ цифровых изображений сосудов сетчатки.

Производили компьютерный анализ изображений сетчатки, полученных с помощью инвертированного микроскопа Olimpus KX-100 с цифровой фотокамерой Olympus DP72 и объективами 10х, 20х, 40х в свете флуоресценции Су3 и FITC. С помощью автоматизированного программного обеспечения SWIFT_NV была проведена количественная оценка средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя.

Результаты

В группе экспериментальных животных выявлено достоверное снижение уровня содержания мембранных белков плотных контактов - окклюдина, клаудина -1, -2 и -5, что свидетельствует о нарушении проницаемости гематоретинального барьера. В группах животных с применением фенофибратной композиции и комбинированным ее применением с пиоглитазоном уровень содержания белков плотных контактов был выше (р<0,05), чем в экспериментальной группе; в группе с комбинированным применением препаратов уровень клаудина-5 составлял 89 ± 3,2%, окклюдина - 85 ± 4,3%, клаудина-2 и клаудина-1 - 78 ± 7,2% и 74 ± 6,1% соответственно (рисунок).

Мембранные белки плотных контактов (окклюдин, клаудин -1-2-5) у животных с кислород-индуцированной ретинопатией при инстилляции фенофибратной композиции и интравитреальном введении пиоглитазона

Примечание: * p<0,05 - достоверность различий в группах ЭЖ и ИЖ

▪ p<0,05 - достоверность различий с группой ЭЖ

Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение фенофибрата в используемой композиции позволяет предотвратить резкое нарушение проницаемости гематоретинального барьера.

Уровень содержания ФНО-α на 15-е сутки во всех группах животных с использованием фенофибратной композиции и пиоглитазона был достоверно ниже, чем в группе экспериментальных животных, в группе с комбинированным применением препаратов его уровень был снижен в 2,8 раза и достоверно отличался от групп с изолированным применением. Уровень содержания ФНО-α на 18-е сутки при использовании фенофибратной композиции и комбинированного применения препаратов достоверно не отличался от уровня его содержания в интактной группе и был достоверно ниже, чем в группе с интравитреальным введением пиоглитазона (табл. 1).

Таблица 1

Уровень содержания ФНО-α (пг/мг) у животных с кислород-индуцированной ретинопатией при инстилляциях фенофибратной композиции и интравитреальном введении пиоглитазона

Группы животных

Сутки наблюдения

15

18

Фенофибрат

115,4 ± 4,17*

68,13 ± 1,23*

Пиоглитазон

145,3 ± 5,21*

82,23 ± 4,23*†

Фенофибрат + Пиоглитазон

75,21 ± 6,23*†

61,12 ± 3,23*

Экспериментальные животные

207,19 ± 18,32

121,31 ± 10,12

Интактные животные

54,53 ± 8,08

53,02 ± 9,91

*p<0,05 - достоверность различий с ЭЖ

†p<0,05 - достоверность различий между группами с применением препаратов

Во всех группах животных с использованием фенофибрата и пиоглитазона на 15-е и 18-е сутки уровень содержания молекулы клеточной адгезии ICAM-1 был достоверно ниже, чем в группе экспериментальных животных, достоверной разницы между группами выявлено не было (табл. 2).

Таблица 2

Уровень содержания ICAM-1 (пг/мг) у животных с кислород-индуцированной ретинопатией при инстилляциях фенофибратной композиции и интравитреальном введении пиоглитазона

Группы животных

Сутки наблюдения

15-е

18-е

Фенофибрат

241,4 ± 7,37*

215,4 ± 6,37*

Пиоглитазон

251,1 ± 6,65*

230,3 ± 9,21*

Фенофибрат + пиоглитазон

243,5 ± 5,48*

225,2 ± 7,27*

Экспериментальные животные

309,2 ± 6,13

280,8 ± 5,23

Интактные животные

165,1 ± 4,45

150,9 ± 4,27

*p<0,05 - достоверность различий с ЭЖ

 

Уровень содержания VEGF на 15-е и 18-е сутки во всех группах был достоверно ниже, чем в группе экспериментальных животных, на 15-е сутки в группе животных с комбинированным применением был ниже, чем при изолированном их применении (р<0,05) и во всех группах достоверно выше, чем в группе сравнения c интравитреальным введением ранибизумаба (табл. 3).

Таблица 3

Уровень содержания VEGF (пг/мг) у животных с кислород-индуцированной ретинопатией при инстилляциях фенофибратной композиции и интравитреальном введении пиоглитазона

Группы животных

Сутки наблюдения

15-е

18-е

Фенофибрат

28,32 ± 0,34 * V

3,65 ± 0,08*

Пиоглитазон

25,78 ± 1,23*  V

3,21 ± 0,07*

Фенофибрат + пиоглитазон

23,31 ± 0,18*† V

3,12 ± 0,02*

Ранибизумаб

19,12 ± 0,15*

2,93 ± 0,05*

Экспериментальные животные

37,15 ± 16,45

5,0 ± 0,04

Интактные животные

10,05 ± 1,08

2,53 ± 0,09

*p<0,05 - достоверность различий с ЭЖ

†p<0,05 - достоверность различий между группами с применением препаратов

?Vp<0,05 - достоверность различий с группой сравнения

Площадь ретинальной неоваскуляризации в группах с изолированным и комбинированным применением фенофибратной композиции и пиоглитазона была достоверно меньше, чем в экспериментальной группе, достоверной разницы между группами выявлено не было (табл. 4).

Таблица 4

Площадь ретинальной неоваскуляризации у животных с кислород-индуцированной ретинопатией при инстилляциях фенофибратной композиции и интравитреальном введении пиоглитазона (18-е сутки)

Группы животных

Площадь ретинальной неоваскуляризации (%)

Фенофибрат

1,6 ± 0,03*

Пиоглитазон

1,8 ± 0,03*

Фенофибрат + Пиоглитазон

1,3 ± 0,02*

Ранибизумаб

1,7 ± 0,04*

Экспериментальные животные

4,9 ± 0,21*

*p<0,05 - достоверность различий с ЭЖ

 

Между уровнем содержания ФНО-а, VEGF и площадью ретинальной неоваскуляризации при использовании препаратов агонистов PPARа и PPARγ выявлено наличие средней корреляционной зависимости (r = 0,54; р<0,05 и r = 0,61; р<0,05 соответственно), что свидетельствует о наличии у представителей этих групп препаратов других ангиогенных механизмов.

Выводы:

1. При использовании фенофибратной композиции в виде инстилляций у животных с кислород-индуцированной ретинопатией сохраняется более высокий (р<0,05), чем в экспериментальной группе, уровень содержания мембранных белков плотных контактов – окклюдина и клаудина-1, -2 и - 5 в ретинальной ткани, что свидетельствует о предотвращении резкого нарушения проницаемости гематоретинального барьера.

2. При использовании фенофибратной композиции и пиоглитазона у животных с кислород-индуцированной ретинопатией достоверно снижается уровень содержания ФНО-α, наиболее выраженный результат (р<0,05) наблюдается на 15-е сутки при комбинированном их применении.

3. При изолированном и комбинированном применении фенофибрата и пиоглитазона без достоверной разницы у животных с кислород-индуцированной ретинопатией на 15-е сутки снижается (р<0,05) уровень содержания ICAM-1.

4. Уровень содержания VEGF на 15-е и 18-е сутки во всех группах животных с применением фенофибрата и пиоглитазона достоверно ниже, чем в группе экспериментальных животных, наиболее выраженный результат наблюдается в группе животных с комбинированным их применением на 15-е сутки. Во всех группах животных на 15-е сутки уровень содержания VEGF достоверно выше, чем в группе c интравитреальным введением Ранибизумаба.

5. Площадь ретинальной неоваскуляризации в группах с изолированным и комбинированным применением фенофибратной композиции и пиоглитазона достоверно меньше, чем в экспериментальной группе.

6. Между уровнем содержания ФНО-а, VEGF и площадью ретинальной неоваскуляризации при использовании препаратов агонистов PPARа и PPARγ наблюдается наличие средней корреляционной зависимости, что свидетельствует о наличии у представителей этих групп препаратов других ангиогенных механизмов.

Наличие при использовании фенофибрата и пиоглитазона более высокого уровня содержания VEGF, чем при применении ранибизумаба, может иметь определенное положительное значение. При их применении одновременно с анти-VEGF препаратами, количество использования последних может быть ограничено и могут быть предотвращены, соответственно, их возможные неблагоприятные эффекты - апоптоз эндотелиальных клеток и ишемия (используемые на сегодняшний день анти-VEGF препараты не являются селективными).

Полученные результаты свидетельствуют о возможности и эффективности применения агонистов PPARа и PPARγ при патологии, связанной с формированием патологической неоваскуляризации; с целью уточнения механизмов их действия необходимо проведение дальнейших исследований.