Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Встречающиеся формы туберкулезного воспаления многообразны [5], их существование во многом обусловлено, с одной стороны, различием чувствительности и жизнеспособности патогена, с другой – адекватностью реагирования иммунной системы. В организме M.tuberculosis вызывает комплекс иммунологических реакций, характеризуемых как специфический воспалительный ответ [3], в результате чего формируется инфильтративный туберкулез легких, фиброзно-кавернозный туберкулез или отграниченный специфический процесс – туберкулема. Установлено, что активация туберкулезного процесса сопровождается снижением количества лимфоцитов, в том числе CD3⁺ и CD4⁺клеток, увеличением экспрессии HLA-DR-Ag на лимфоцитах [1, 4]. Однако изучение реагирования лимфоцитов, которые наряду с фагоцитами играют существенную роль в формировании иммунитета и противостоянии инфекции [2], остается важным в связи с тем, что они обеспечивают более специализированную защиту, чем фагоцитоз.

Оценку активности туберкулемы в настоящее время осуществляют на основании данных патогистологического исследования в послеоперационном периоде. Изучение иммунологических показателей, встречающихся у больных с разной активностью туберкулемы, позволит дифференцировать фазу активности с учетом данных гематологических исследований. Целью данного исследования стала сравнительная оценка количественного и функционального состояния Т-лимфоцитов при разных фазах активности туберкулемы.

Материалы и методы исследования

В исследовании приняли участие 56 человек, из которых 31 был болен туберкулезом легких с формированием ограничения специфического процесса – туберкулемы, в том числе  вызванным лекарственно устойчивыми изолятами M.tuberculosis и 25 практически здоровых добровольцев. Больные проходили лечение в ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России (директор – д.м.н. С. Н. Скорняков) с 2011 по 2013 год в туберкулезном легочно-хирургическом отделении, заведующие: П. Ф. Гапонюк (2011–2012 годы), к.м.н. А. В. Неретин (2013 год). Средний возраст обследованных составил 32,4±1,6 года. В группу вошли 18 мужчин (58 %) и 13 (42 %) женщин. Сопутствующая патология в стадии ремиссии встречалась у 18 больных (58 %). На основании данных патогистологического заключения больные были разделены на 2 подгруппы. В первую из них были включены 16 пациентов с туберкулемой в активной фазе, во вторую – 15 больных с туберкулемой в фазе стихающей и умеренной активности. У больных с активной туберкулемой средний возраст на момент первичного выявления заболевания составил 29,1±2,4 года, к моменту формирования туберкулемы – 32,4±2,5 года. Жалобы перед госпитализацией предъявляли 3 человека (18,8 %). Бактериовыделение на момент проведения иммунологического исследования у всех больных отсутствовало. Среди всех исследованных резектатов операционного материала  рост M.tuberculosis был выявлен в 9 случаях. Исследование лекарственной чувствительности показало, что чувствительными оказались 3 образца (33,3 %), у 6 пациентов (66,6 %) отмечена устойчивость к 2 и более противотуберкулезным препаратам. У больных с туберкулемами в фазе стихающей и умеренной активности средний возраст на момент выявления заболевания составил 30,1±2,2 года, к моменту формирования туберкулемы – 32,1±1,9 года. Жалобы перед госпитализацией предъявил 1 пациент. При исследовании операционного материала обнаружено, что из 8 обследованных в 2 (25,0 %) случаях возбудитель заболевания оказался лекарственно чувствительным, в 6 (75,0 %) – была выявлена множественная лекарственная устойчивость. Группа здоровых добровольцев была представлена 15 (60,0 %) мужчинами и 10 (40,0 %) женщинами, средний возраст обследуемых составил 36,0±2,8 лет. На момент обследования у доноров отсутствовали острые заболевания, хронические находились в стадии ремиссии. Все обследованные имели отрицательные клинико-лабораторные данные наличия вирусных гепатитов В, С, вируса иммунодефицита человека. Кровь для исследования забиралась однократно до начала лечения, при поступлении в стационар. Клинико-рентгенологический статус пациента устанавливался при поступлении его в учреждение и на этапах лечения в соответствии со стандартами оказания медицинской помощи больным туберкулезом (Приказ Минздравсоцразвития РФ № 572 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным туберкулезом» от 21.07.2006 г.).

Для оценки основных показателей клеточного иммунитета использовалась цельная кровь с антикоагулянтом К₃ЭДТА в концентрации 1,6 мг/мл. Общий анализ крови выполнялся на гематологическом анализаторе 5 DiffMythic 22 AL (Cormay, Poland). Дополнительно изучали основные субпопуляции лимфоцитов, используя моноклональные антитела фирмы BeckmanCoulter (USA). Лизис эритроцитов осуществляли с помощью станции пробоподготовки Coulter® Q-Prep (BeckmanCoulter, USA) и реагентов Immunoprep одноименной компании. Контроль качества проводили при помощи калибровочных частиц FlowCheck. Для детекции лейкоцитов использовали линейный дифференцировочный маркер CD45⁺. Подсчитывали общее количество Т-лимфоцитов (CD45⁺CD3⁺). Определяли субпопуляции Т-лимфоцитов: устанавливали количество Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺), число Т-цитотоксических клеток (CD3⁺CD8⁺), оценивали популяцию γδ-T-лимфоцитов (CD3^brightCD4⁼), число TNK-клеток (CD3⁺CD16⁺56⁺), количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих альфа-цепь рецептора IL-2 (CD3⁺CD25⁺), число активированных Т-хелперов (CD3⁺СD4⁺CD25^high), популяцию Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркер поздней активации  HLA-DR-Ag (CD3⁺HLA-DR⁺), клеток, экспрессирующих маркер готовности к апоптозу (CD3⁺CD95⁺), субпопуляцию Т-хелперов, несущих маркеры готовности к апоптозу (CD3⁺CD4⁺CD95⁺), Т-регуляторных клеток (CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺). Дополнительно рассчитывали отношение CD4⁺/CD8⁺. Статистическая обработка данных проведена с использованием программ «MicrosoftOfficeExcel 2007» и «StatisticaforWindows v.6.1». Проверку гипотезы о нормальном распределении, а также о согласии ее с распределением генеральной совокупности выполняли, используя χ²-Пирсона. Для оценки полученных результатов были использованы непараметрические методы. Вычислялись: среднее арифметическое значение величины (М), среднее квадратическое отклонение (σ), статистическая медиана (Ме), минимальное (Min), максимальное значение (Max). Оценку значимости различий между выборками проводили попарно, применяли критерий U – Манна – Уитни. При величине p<0,05 нулевая гипотеза (отсутствие отличий между выборками) отвергалась, и статистические различия между группами считались значимыми.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ результатов проведенных исследований показал, что общее количество лимфоцитов у больных с туберкулемами было выше, чем у здоровых индивидуумов (табл.). Их количество было достоверно повышено при активных туберкулемах (на 43,7 %), и немного – при туберкулемах в фазе стихающей активности (на 9,7 %). Популяция Т-лимфоцитов увеличивалась при разных фазах активности: незначительно при активных туберкулемах, наибольшее увеличение выявлено при туберкулемах в фазе стихающей активности, которое составило 13,3 % в сравнении с группой добровольцев.

Исследованные субпопуляции Т-лимфоцитов у здоровых добровольцев и у больных с разными фазами активности туберкулемы

Где, 1 – М, 2 – М±σ, 3 – Min, 4 – Max, 5 – Me, *р – в сравнении с контрольной группой, #р – в сравнении с группой больных с активными туберкулемами, отн. ед. – относительные единицы.

Подробное изучение некоторых субпопуляций Т-лимфоцитов показало следующее. Число Т-хелперов несколько повышалось в обеих подгруппах – на 8,7 % при активных туберкулемах и на 23,9 % при туберкулемах со стихающей и умеренной активностью в сравнении с контрольной группой (р<0,05). Доля этих клеток, определяемая от численности всей популяции Т-лимфоцитов, подчинялась тем же закономерностям.

Популяция Т-цитотоксических клеток была сходной в исследованных подгруппах – абсолютное количество клеток мало варьировало относительно показателя здоровых лиц.

В связи с тем, что число Т-цитотоксических клеток не изменялось, а количество Т-хелперов увеличивалось, в подгруппе больных, имеющих туберкулемы в фазе стихающей и умеренной активности, на 21,4 % в сравнении с группой доноров увеличивалось и отношение CD4⁺/CD8⁺ Т-лимфоцитов (р<0,05). В подгруппе больных, имеющих активную туберкулему, оно снижалось на 8,2 %. Данный показатель может быть использован для дифференциальной диагностики активности туберкулемы.

γδ-Т-лимфоциты могут выступать как в роли цитотоксических клеток, так и клеток-эффекторов, регуляторов иммунного ответа. Антигенный рецептор этих клеток способен непосредственно связываться с эпитопом антигена. Количество их у больных с туберкулемами в разных фазах активности изменялось различно. При активных туберкулемах количество этих клеток незначительно снижалось – на 12,1 % в сравнении с показателями здоровых лиц. В подгруппе больных с туберкулемами в фазе стихающей активности число γδ-Т-клеток возрастало: в 2 раза в сравнении с группой доноров и в 2,3 раза в сравнении с подгруппой больных, имеющими туберкулемы в активной фазе. В связи с тем, что γδ-Т-клетки играют важную роль в сопротивляемости организма туберкулезной инфекции, можно предположить, что нарастание пула этих клеток в организме сопряжено с тенденцией к ликвидации очага инфекции, вызванной M.tuberculosis, в свою очередь снижение их количества обуславливает наличие активного патологического процесса.

При исследовании популяции T-NK-клеток была выявлена тенденция к увеличению числа этих клеток при туберкулемах. Активные туберкулемы сопровождались повышением количества T-NK-клеток на 21,0 % (р<0,05), туберкулемы в фазе стихающей и умеренной активности – на 12,9 % в сравнении с контрольной группой.

Помимо количественной оценки отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов, проводилось изучение некоторых маркеров активации клеток. Первым маркером был рецептор  IL-2 – CD25, экспрессируемый на поверхности лимфоцитов. У больных с туберкулемами в активной фазе количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD25⁺ (CD3⁺CD25⁺) увеличивалось на 15,8 %. При туберкулемах в фазе стихающей активности абсолютное количество активированных Т-лимфоцитов повышалось на 25 % в сравнении с контрольной группой (р<0,05), а также на 8 % в сравнении с уровнем пациентов, имеющим активные туберкулемы.

Анализ экспрессии CD25⁺ на Т-хелперах выявил увеличение пула данных клеток (CD3⁺CD4⁺CD25⁺) в подгруппе больных с туберкулемами в фазе стихающей и умеренной активности на 42,1 % в сравнении, как с контрольной группой, так и с подгруппой больных, имеющих активные туберкулемы. Очевидно, что активированные Т-клетки являются прямыми участниками снижения активности туберкулемы.

Другой маркер активации – экспрессия HLA-DR-Ag на лимфоцитах – маркер поздней активации Т-лимфоцитов. Изучение полученных данных показало, что при активных туберкулемах число CD3⁺HLA-DR-Ag⁺-клеток увеличивалось на 6,7 %, а при туберкулемах в фазе стихающей активности снижалось в 2,1 раза в сравнении с показателем здоровых лиц.

Молекула CD95 – маркер готовности к апоптозу. Его экспрессия была оценена на всех Т-лимфоцитах и на Т-хелперах. Количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности этот белок, в первой подгруппе увеличивалось на 5,1 %, тогда как во второй – на 28,2 % в сравнении с показателями здоровых лиц. Оценивая экспрессию CD95 на Т-хелперах, было обнаружено, что число этих клеток также возрастало у пациентов с активными туберкулемами на 33,3 %, у больных с туберкулемами в фазе стихающей активности – на 42,9 % относительно группы доноров. Одной из функций CD95 является участие в регулируемом процессе удаления активированных Т-лимфоцитов в момент прекращения необходимости в них на этапах развития иммунного ответа. Туберкулемы в фазе стихающей активности характеризуются «затуханием» иммунологических реакций, что коррелирует с появлением высокой концентрации маркеров апоптоза на Т-лимфоцитах.

Количество регуляторных Т-клеток (CD3⁺CD4⁺CD127^-CD25⁺) было повышенным в обеих подгруппах в сравнении с контролем: в первой на 60 % (p<0,05), во второй – на 40 % (p<0,05). Их основной задачей является координация иммунного ответа – его силы и продолжительности. Очевидно, что численность Т-reg-клеток отражает активность иммунологических процессов, которая связана с активностью туберкулемы.

Заключение

В целом можно отметить, что Т-клеточный компонент иммунной системы у больных с активной туберкулемой характеризуется увеличением общего количества лимфоцитов, повышением экспрессии CD25⁺ и HLA-DR на Т-лимфоцитах, CD95⁺ на Т-хелперах, снижением числа γδ-Т-клеток и индекса CD4⁺/CD8⁺, а также увеличением количества Т-NK-лимфоцитов и Т-reg-клеток. Туберкулемы в фазе умеренной и стихающей активности сопровождаются повышением экспрессии CD25⁺ и СD95⁺ на Т-лимфоцитах и Т-хелперах, а также снижением экспрессии HLA-DR на Т-лимфоцитах, отмечается выраженное снижение количества NK-клеток и увеличение γδ-Т-клеток, ассоциированное с повышением количества Т-reg-клеток и индекса CD4⁺/CD8⁺. Полученные данные позволяют использовать лабораторные иммунологические показатели для косвенной оценки активности туберкулемы.