Группа препаратов атипичных нейролептиков в последнее время стали все больше применяться для лечения различных психических заболеваний. Одним из представителей этой группы является оланзапин, который по механизму фармакологического действия характеризуется взаимодействием с несколькими различными нейромедиаторными системами: дофаминовыми, серотониновыми, норадренергическими, холинергическими и гистаминовыми рецепторами. Препарат широко применяют при шизофрении и других заболеваниях. Известны случаи отравления оланзапином со смертельным исходом. Клинические симптомы и патоморфологическая картина при отравлениях оланзапиномнехарактерны[5]. В связи с этим его определение во внутренних органах и биологических объектах является решающим в диагностике смертельных отравлений.
Целью настоящего исследования явилось определение степени извлечения оланзапина из модельных проб печени и почек классическими методами, а также разработка оптимальной методики его изолирования.
Материалы и методы исследования. Приготовление модельных проб печени и почек. К 10 г измельченных до размера 0,5×0,5×0,5 см3 печени и почек (по отдельности) добавляли раствор оланзапина в терапевтической, токсической и летальной концентрации. Таким образом, концентрация оланзапина во внутренних органах была 1,5; 4,0; 8,5 мкг. Внутренние органы оставляли на 24 часа при комнатной температуре.
Метод Стаса-Отто: 10,0 г биоматериала измельчали и заливали абсолютным этанолом, подкисляли щавелевой кислотой до рН=2-3. Перемешивали и проверяли значение рН, настаивали при комнатной температуре в течение суток при периодическом перемешивании и проверяли значение рН. Жидкую фазу сливали, операцию повторяли 2-3 раза (в течение 2-3 суток), затем биоматериал помещали на фильтр и промывали спиртом; спиртовые вытяжки объединяли и упаривали на водяной бане при 40-50°С до густоты сиропа. Сиропообразную жидкость обрабатывали этанолом до прекращения выпадения осадка, жидкость фильтровали, снова упаривали до густоты сиропа и вновь осаждали белки. Остаток обрабатывали 20-25 мл воды, осадок отфильтровывали, проводили экстракцию хлороформа (2-3 порции), получали кислое хлороформное извлечение. Водную фазу подщелачивали 25% раствором NH4OH до рН=9-10, извлекали хлороформом (2-3) порции, получали щелочное хлороформное извлечение.
Метод А.А. Васильевой: 10,0 г биоматериала измельчали и заливали водой, подкисляли щавелевой кислотой и настаивали при комнатной температуре в течение 1 часа, перемешивали, проверяли значение рН, вытяжку фильтровали, центрифугировали и экстрагировали хлороформом (трижды) - осторожно, во избежание эмульгирования с водой. Водную фазу подщелачивали 20% NaOH и трижды экстрагировали хлороформом.
Метод В.Ф. Крамаренко: 10,0 гбиоматериала измельчали и заливали 0,02М раствором H2SO4 до рН=2,5, настаивали 2 часа при периодическом перемешивании, проверяли рН, водный слой процеживали. Операцию проводили 2 раза. Водную вытяжку объединяли, центрифугировали, добавляли сульфат аммония до насыщения, центрифугировали, и извлекали эфиром 2-3 раза. К водной фазе прибавляли небольшими порциями раствор NaOH 20% до рН=9-10 и экстрагировали эфиром или хлороформом.
Обнаружение и количественное определение оланзапина проводили методом ВЭЖХ. Использовали следующие условия хроматографирования: хроматографическая колонка размером 2×75 мм, заполненная обращено-фазовым сорбентом «ProntoSil 120-5-C18 AQ»; подвижная фаза: элюент А - 0,1% раствор кислоты трифторуксусной, элюент Б - ацетонитрил; скорость потока - 100 мкл/мин; время измерения 0,18 с; температура термостата колонки - комнатная, объем пробы 2 мкл, длина волны - 270 нм. Для выяснения характеристик удерживания оланзапина выполняли анализ в градиентном режиме от 10% элюента Б до 90% за 15 мин.
Полученные данные статистически обрабатывали с помощью пакета программ EL.
Результаты исследования и обсуждение. Нами были получены следующие данные при использовании метода Стаса-Отто, представленные в таблицах 1 и 2.
Таблица 1
Степень извлечения оланзапина из печени
Внесено, мкг |
Степень извлечения, % |
Метрологические характеристики |
1,5 |
50,54; 49,23; 53,76; 48,44; 52,05; 51,19 |
Δ |
4,0 |
51,56; 50,34; 48,12; 49,65; 52,32; 50,65 |
Δ |
8,5 |
47,45; 50,49; 48,78; 52,19; 49,98; 51,14 |
Δ |
Полученные данные свидетельствуют о том, что методом Стаса-Отто из печени изолируется 50,01- 50,87 % оланзапина. Относительная ошибка определения не превышает
± 4 %.
Таблица 2
Степень извлечения оланзапина из почек
Внесено, мкг |
Степень извлечения, % |
Метрологические характеристики |
1,5 |
45,74; 49,52; 48,78; 48,44; 46,33; 48,61 |
Δ |
4,0 |
49,26; 47,45; 48,58; 45,21; 46,06; 50,21 |
Δ |
8,5 |
48,45; 49,57; 50,50; 47,11; 45,74; 46,33 |
Δ |
Полученные данные свидетельствуют о том, что методом Стаса-Отто из почек изолируется 47,78 - 47,95 % оланзапина. Относительная ошибка определения не превышает ± 5 %.
Степень извлечения оланзапина при изолировании методом А.А.Васильевой из модельных проб внутренних органов представлена в таблицах 3 и 4.
Таблица 3
Степень извлечения оланзапина из печени
Внесено, мг |
Степень извлечения, % |
Метрологические характеристики |
1,5 |
60,67; 61,65; 59,89; 62,43; 64,26; 57,55 |
Δ |
4,0 |
58,96; 59,54; 65,44; 61,47; 60,89; 63,78 |
Δ |
8,5 |
64,44; 61,38; 60,65; 60,83; 57,92; 59,16 |
Δ |
Полученные данные свидетельствуют о том, что методом А.А. Васильевой из печени изолируется 60,73 - 61,68 % оланзапина. Относительная ошибка определения не превышает ± 5%.
Таблица 4
Степень извлечения оланзапина из почек
Внесено, мг |
Степень извлечения, % |
Метрологические характеристики |
1,5 |
55,15; 59,68; 57,43; 58,83; 60,72; 56,06 |
Δ |
4,0 |
60,84; 56,54; 59,38; 56,15; 58,08; 57,75 |
Δ |
8,5 |
59,52; 60,87; 55,94; 57,67; 58,05; 60,19 |
Δ |
Полученные данные свидетельствуют о том, что методом А.А. Васильевой из почек изолируется 57,98 - 58,71 % оланзапина. Относительная ошибка определения не превышает ± 4%.
Данные по определению оланзапина методом В.Ф. Крамаренко из модельных проб внутренних органов представлены в таблице 5 и 6.
Таблица 5
Степень извлечения оланзапина из печени
Внесено, мг |
Степень извлечения, % |
Метрологические характеристики |
1,5 |
52,26; 50,45; 51,81; 49,35; 54,77; 55,38 |
Δ |
4,0 |
50,26; 52,12; 49,88; 53,23; 55,67; 54,54 |
Δ |
8,5 |
52,57; 49,43; 50,66; 55,34; 54,38; 53,52 |
Δ |
Полученные данные свидетельствуют о том, что методом В.Ф. Крамаренко из печени изолируется 52,34 - 52,65 % оланзапина. Относительная ошибка определения не превышает ±5 %.
Таблица 6
Степень извлечения оланзапина из почек
Внесено, мг |
Степень извлечения, % |
Метрологические характеристики |
10,0 |
47,68; 49,77; 50,43; 51,42; 53,79; 51,15 |
Δ |
25,0 |
49,54; 50,76; 52,12; 53,43; 54,18; 46,64 |
Δ |
400,0 |
46,46; 47,78; 49,53; 52,12; 55,59; 51,30 |
Δ |
Полученные данные свидетельствуют о том, что методом В.Ф. Крамаренко из почек изолируется 50,46 - 51,11 % оланзапина. Относительная ошибка определения не превышает ±7 %.
Как следует из представленных данных, наибольшее количество оланзапина (из почек 57,98 - 58,71 % и из печени 60,73 - 61,68 %) изолируется методом А.А. Васильевой. Тем не менее, это количество не приближается к максимальному.
Для разработки оптимальной методики изолирования оланзапина из модельных проб внутренних органов первоначально нами изучено влияние некоторых факторов на его экстракцию из растворов. Оптимальным органическим растворителем для экстракции оланзапина в максимальном количестве из водных растворов является хлороформ при pH=2 и 12. Натрия сульфат насыщенный - электролит, который обладает высаливающим действием для оланзапина (степень экстракции 93,26%)[1].
Изолирование оланзапина из внутренних органов по разработанной методике. Навеску измельченного объекта заливали 40% раствором этанола (1:2), подкисляли 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН=2, проводили настаивание 2 ч при периодическом взбалтывании. К водной фазе добавляли 5 мл диэтилового эфира, органический слой отбрасывали. К водной фазе прибавляли 1 мл раствора натрия сульфата насыщенного и 3 мл хлороформа. Содержимое колбы взбалтывали в течении 5 минут и помещали в делительную воронку. После разделения фаз отделяли слой органического растворителя. Растворители удаляли при комнатной температуре. Сухие остатки, полученные после испарения экстрагента, растворяли в 5 мл 96% этанола и проводили количественное определение оланзапина методом ВЭЖХ. Водную фазу подщелачивали 25% раствором аммиака до рН 12, прибавляли 1 мл раствора натрия сульфата насыщенного и 3 мл хлороформа. Содержимое колбы взбалтывали в течении 5 минут и помещали в делительную воронку. После разделения фаз отделяли слой органического растворителя. Растворители удаляли при комнатной температуре. Сухие остатки, полученные после испарения экстрагента, растворяли в 5 мл 96% этанола. Обнаружение и количественное определение оланзапина проводили методом ВЭЖХ [3].
Полученные данные представлены в таблицах 7, 8.
Таблица 7
Степень извлечения оланзапина из печени
Внесено, мкг |
Извлечение из раствора с рН=2 |
Извлечение из раствора с рН=12 |
||
Степень извлечения, % |
Метрологические характеристики |
Степень извлечения, % |
Метрологические характеристики |
|
1,5 |
79,28; 77,31; 80,26; 73,44; 76,58; 78,35 |
Δ |
86,43; 89,90; 82,33; 87,65; 85,41; 88,54 |
Δ |
4,0 |
73,37; 79,23; 78,47; 81,02; 77,17; 75,14 |
Δ |
83,57; 86,72; 89,62; 85,35; 87,28; 88,80 |
Δ |
8,5 |
80,54; 76,21; 79,42; 80,09; 74,31; 75,41 |
Δ |
86,37; 90,05; 84,21; 87,36; 83,75; 88,19 |
Δ |
В извлечении из раствора с рН=2 удается обнаружить 77,40-77,66 % оланзапина, в то время как в извлечении из раствора с рН=12 - 86,16 -86,89%.
Таблица 8
Степень извлечения оланзапина из почек
Внесено, мкг |
Извлечение из раствора с рН=2 |
Извлечение из раствора с рН=12 |
||
Степень извлечения, % |
Метрологические характеристики |
Степень извлечения, % |
Метрологические характеристики |
|
1,5 |
69,23; 74,38; 75,62; 70,77; 72,16; 71,49 |
Δ |
82,44; 86,55; 81,06; 83,49; 80,83; 83,24 |
Δ |
4,0 |
68,35; 72,61; 71,00; 75,42; 73,19; 70,24 |
Δ |
85,48; 81,23; 82,65; 80,41; 84,57; 84,12 |
Δ |
8,5 |
70,11; 71,85; 72,42; 73,39; 74,58; 75,93 |
Δ |
80,26; 86,39; 84,43; 85,03; 81,18; 82,21 |
Δ |
Полученные данные коррелируют с результатами экстракции оланзапина из водных растворов. В извлечении из раствора с рН=2 удается обнаружить 71,80- 73,05 % оланзапина, в то время как в извлечении из раствора с рН=12 - 82,94- 83,25 % [4].
Разработанные методики количественного определения оланзапина из печени и почек с использованием ВЭЖХ валидированы по показателям: специфичность, линейность, прецезионность, правильность, предел количественного определения, степень извлечения и стабильность аналита. Так как степень извлечения оланзапина из раствора с рН=2 и из раствора с рН=12 более 50%, то нами рекомендуется использовать при направленном анализе извлечение как из раствора с рН=2, так и с рН=12. Оценку методики изолирования оланзапина из печени и почек проводили, используя результаты определения оланзапина в извлечении из раствора с рН=12 [3].
Выводы:
1.Определена степень извлечения оланзапина из модельных проб печени и почек классическими методами.
2. Наибольшее количество оланзапина (из почек 57,98 - 58,71 % и из печени 60,73 - 61,68%) изолируется методом А.А. Васильевой.
3. Разработана оптимальная методика изолирования оланзапина из модельных проб печени и почек.
Рецензенты:Коновалов Д.А., д.фарм.н., заместитель директора по науке, заведующий кафедрой фармакогнозии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский медицинский университет» МинздраваРФ, г. Пятигорск;
Оганесян Э.Т., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой органической химии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский медицинский университет» МинздраваРФ, г. Пятигорск.