К концу 1960-х гг. серологическими методами анализа было доказано наличие в составе головного мозга органоспецифических антигенов [6]. Наиболее известными представителями нейроспецифических белков являются белок S-100 [10], нейроспецифическая енолаза (NSE или антиген 14-3-2) [9], альфа-2-гликопротеин Варецкой (α2-GP) [7] и глиофибриллярный кислый антиген (GFAP) [6].
Совершенствование техники фракционирования белков, применение методов иммунохимического анализа значительно расширили наши знания об антигенном составе нервной ткани [2, 3]. Доказательством этого являются публикации в последние годы ряда обзоров и монографий, посвященных иммунохимической характеристике протеинов, специфических для центральной и периферической нервной системы [6], появление научного журнала «Нейрохимия».
Помимо вышеперечисленных нейробелков S-100, НСЕ (14-3-2), α2-GP и GFAP [6, 9, 10], в литературе имеются единичные описания кислых антигенов мозга: «А» и «Д», «а»-протеина, белков группы «В», антигенов «SPR», альфа «BASNT» и «SRANT», термостабильного спиртонерастворимого протеина, альфа2-мозгоспецифического антигена и целого ряда представителей «основных» белков головного мозга [7]. Отличительной особенностью всех этих идентифицированных нейробелков является то, что их молекулярные массы не превышают 50-60 КДа [6, 7].
Основная масса водорастворимых тканевых и сывороточных белков более высокой молекулярной массы денатурирует в экстремальных физико-химических условиях, для их выделения и очистки требуются достаточно мягкие физиологические условия фракционирования [7]. Однако существует небольшая группа водорастворимых белков, способных сохранять свои нативные свойства при жестких методах фракционирования (так, например, ферритин выдерживает длительное кипячение [4], эмбриональный преальбумин - обработку сильными органическими кислотами [2], фетальный гемоглобин - растворами щелочей [4], белок S-100 - насыщенными растворами сульфата аммония [10], альфа-фетопротеин - спиртовым раствором трихлоруксусной кислоты [7] и т.д.). Такие белки-«экстремалы» привлекают внимание биохимиков легкостью своего получения, особенностью своего строения, обеспечивающего уникальную стабильность макромолекулы и биологической функции, физиологов увлекают на поиск особенной биологической роли таких белков в патогенезе, а клиницистов - перспективой их клинического применения.
Все вышесказанное относится и к исследованиям нейроспецифических белков с подобными свойствами и их приложению к клиническим проблемам неврологии и нейрохирургии.
Цель исследования
Поиск новых нейроспецифических белков с экстремальными физико-химическими характеристиками и оценка значения иммунохимических тестов на эти нейробелки для диагностики и прогнозирования нейротравмы.
Материалы и методы
Биологический материал получали в бюро судебно-медицинской экспертизы г. Астрахани в виде аутопсийного материала мозга от лиц, погибших от случайных причин. К диализованным после центрифугирования продуктам фракционирования экстрактов дефинитивного мозга 10%-ной сульфосалициловой кислотой, насыщенным раствором сульфата аммония или термообработкой при 100°С × 10 мин получали антисыворотки путем иммунизации кроликов по общепринятым схемам с полным адьювандтом Фрейнда.
После абсорбции антисывороток сывороткой крови доноров и сухой плазмой, а также смесью экстрактов различных органов удалось получить моноспецифические антисыворотки к трем органоспецифическим антигенам мозга, аналогичным описанным в литературе нейроспецифическим антигенам: термостабильному антигену Каспари-Филда или к альфа1-BE-глобулин мозга [7], кислотостабильному антигену мозга, идентичному альфа-2-СС-глобулины мозга [7] и органоспецифическому белку мозга, растворимому в насыщенном сульфате аммония, иммунохимически идентифицированному как белок S-100 [10].
Моноспецифические тест-системы к альфа1- и альфа2-глобулинам мозга и белку S-100 были использованы нами для поиска их в составе сывороточных белков при травматической болезни мозга.
Тяжесть повреждения ЦНС при черепно-мозговых травмах (ЧМТ) различной степени тяжести оценивали по шкале ком Глазго (SCG) [1].
Пробы крови брали: из подключичной вены у больных в отделении реанимации и интенсивной терапии, из локтевой вены у доноров и больных нейрохирургических отделений в стандартных условиях при поступлении или натощак. Образцы сыворотки крови отбирали по 1,5 мл в две пластиковые пробирки «Эппендорф» для исследования и хранили при температуре -25°С до анализа. Кровь забирали на 1-3-е, 5-7-е и 14-19-е сутки после поступления больных в стационар. У части пациентов, перенесших ЧМТ и имевших поздние неврологические осложнения, повторно исследовали кровь в сроки от 3 месяцев до 1 года после нейротравмы.
Клинический материал представлен данными 142 больных мужского и женского пола в возрасте от 19 до 70 лет с изолированными закрытыми черепно-мозговыми травмами различной степени тяжести и 30 больных в возрасте от 23 до 66 лет, госпитализированных с последствиями и осложнениями ЧМТ. Диагноз ставили в соответствии с принятой единой классификацией острой ЧМТ [1]. Больные с ЧМТ условно были разделены на две группы.
В группу пациентов с легкой черепно-мозговой травмой (ЧМТ I) были включены больные с сотрясением головного мозга (СГМ) - 30 человек и ушибом головного мозга (УГМ) легкой степени - 22 человека. Средняя оценка по шкале комы Глазго на момент поступления в клинику составила 13,7±0,09 балла.
Группу с тяжелой черепно-мозговой травмой (ЧМТ II) составили 90 пациентов, из которых 41 пациент с УГМ средней степени тяжести и 49 с тяжелым УГМ и сдавлением головного мозга. Средняя оценка по шкале комы Глазго на момент поступления в клинику составила 8,0±0,19 и колебалась от 11 до 5-4 баллов.
30 пациентов, перенесших ЧМТ и имевших клинические признаки поздних осложнений ЧМТ, составили группу ПО ЧМТ.
Контролем служили 68 образцов сывороток крови доноров обоего пола в возрасте от 30 до 56 лет, полученных из областной станции переливания крови. Общее количество образцов сыворотки крови от 172 пациентов и 68 доноров составило 620 проб.
Полученные результаты подвергались статистической обработке с вычислением средних величин и их ошибок (М ± m), достоверными считались различия при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Сравнительный анализ физико-химических свойств выявленных органоспецифических и межорганных антигенов мозга показал, что нами идентифицированы два новых органоспецифических антигена мозга с отличающимися характеристиками от общеизвестных белков мозга и получена собственная иммунохимическая тест-система на хорошо изученный белок S-100.
Один из нейроспецифических альфа1-глобулин мозга обладает свойством термостабильности (поэтому назван нами альфа1-ТС-глобулин), обратимо осаждается этакридином и сульфатом аммония, необратимо - трихлоруксусной и сульфосалициловой кислотами. Второй обнаруженный нами органоспецифический альфа1-глобулин мозга - кислотостабильный, растворим в хлорной или сульфосалициловой кислоте (назван нами альфа2-КС-глобулином).
Сравнение физико-химических параметров выделенных альфа1- и альфа2-глобулинов мозга с параметрами наиболее известных нейроспецифических белков позволяет заключить, что они не идентичны им, так как молекулярные массы ранее описанных нейроспецифических белков не превышают 40-50 КДа [7], а обнаруженные нами антигены мозга имеют молекулярные массы 139 (альфа1-ТС-глобулин) и 145 КДа (альфа2-КС-глобулин мозга).
На очищенные нейробелки альфа1-ТС-глобулин, альфа2-КС-глобулин сконструированы два варианта иммунохимических тест-систем. Чувствительность ИФА тест-систем составила: для α1-ТС-глобулина мозга 5 нг/мл, для α2-КС-глобулина мозга - 10 нг/мл; ИДА тест-систем - 2 мг/л и 5 мг/л соответственно. Верификацию моноспецифических тест-систем проводили с референтными наборами на эти антигены из банка тест-систем кафедры биохимии Астраханского ГМУ.
Исследование содержания двух новых белков мозга в сопоставлении с нейробелком S-100 в сыворотках крови у пострадавших с ЧМТ выявило следующие закономерности (табл. 1). У пациентов с ЧМТ легкой степени в первые 1-3 дня после травмы ни один из трех исследованных нейробелков достоверно не повышен по сравнению с их уровнем в крови доноров. В эти же сроки после ЧМТ тяжелой степени (ЧМТ II) в крови пострадавших в достоверно повышенных количествах обнаруживался только один из трех нейробелков - мозгоспецифический глиальный антиген S-100 (p<0,001). На 5-7-й день достоверно повышенные концентрации S-100 наблюдали у пострадавших ЧМТ любой степени тяжести (различия по сравнению с контролем достоверны при p<0,05 для группы ЧМТ I и при p<0,001 для групп ЧМТ II).
На 2-3-й неделе сывороточная концентрация белка S-100 быстро снижалась практически до нормы (табл. 1). Однако у пациентов с поздними неврологическими осложнениями ЧМТ (группа ПО ЧМТ) концентрация белка S-100 была достоверно повышена на 50% по сравнению с донорским уровнем этого белка (p<0,001).
В отличие от белка S-100 уровни двух других органоспецифических белков мозга достоверно не повышались при легкой ЧМТ и медленно нарастали в первые три дня тяжелой травмы мозга. α1-ТС-глобулин имел пик в крови больных с тяжелой ЧМТ (ЧМТ II) на 5-7-е сутки с последующим снижением его уровня. Наоборот, статистически значимый повышенный уровень α2-КС-глобулина на 5-7-й день тяжелой ЧМТ продолжал повышаться к 14-19-м суткам (табл. 1).
При отсутствии осложнений ЧМТ уровни всех трех нейробелков в сроки наблюдения от 3 месяцев до 1 года не отличались от контрольных донорских значений. Наоборот, в отдаленные сроки после ЧМТ (90-180 суток) при развитии у пациентов различных поздних неврологических осложнений (группа ПО ЧМТ) концентрации в крови всех трех исследованных нейробелков были достоверно повышены (p<0,001): белка S-100 в 1,5 раза по сравнению с донорским уровнем этого белка, α1-ТС-глобулина - в 2,4 раза и α2-КС-глобулина - в 2,1 раза.
Обнаруженные новые органоспецифические альфа-глобулины мозга могут представлять теоретический интерес для нейрохимии и иметь клиническое значение в диагностике патологии мозга.
Таблица 1
Динамика уровней органоспецифических белков мозга в крови у пациентов с легкой и тяжелой ЧМТ при поступлении и в период поздних осложнений (ПО ЧМТ)
|
Показатели |
Срок после травмы |
ЧМТ I (n=52) |
ЧМТ II (n=90) |
ПО ЧМТ (n=30) |
доноры (n=68) |
|
S-100 (нг/мл) |
1-3-и сутки 5-7-е сутки 14-19-е сутки |
0,7±0,18 0,9±0,24* 0,5±0,16 |
1,2±0,20* 1,3±0,18* 0,5±0,15 |
0,6±0,08*
|
0,4±0,05
|
|
α1-ТС-глобулин (нг/мл) |
1-3-и сутки 5-7-е сутки 14-19-е сутки |
42±12 33±11 45±13 |
47±19 88±20* 59±13 |
104±11*
|
44±17
|
|
α2-КС-глобулин (нг/мл) |
1-3-и сутки 5-7-е сутки 14-19-е сутки |
111±41 122±52 105±47 |
106±28 203±30* 247±29* |
233±41*
|
110±33
|
Примечание: * различия с контрольной группой доноров статистически значимы (р<0,05).
Выводы
1. В экстрактах дефинитивного мозга с помощью кроличьих антисывороток обнаружены три органоспецифических антигена с подвижностью альфа-глобулинов: альфа1-ТС-глобулин мозга (выдерживает термообработку кипячением, идентичен по физико-химическим свойствам ранее описанному антигену Каспари-Филда), альфа2-КС-глобулин мозга (растворим в сульфосалициловой и хлорной кислотах) и белок S-100.
2. На очищенные антигены мозга альфа1-ТС-глобулин, альфа2-КС-глобулин получены моноспецифические антисыворотки и сконструированы два варианта иммунохимических тест-систем. Чувствительность ИФА тест-систем составила: для α1-ТС-глобулина мозга 5 нг/мл, для α2-КС-глобулина мозга - 10 нг/мл; ИДА тест-систем - 2 мг/л и 5 мг/л соответственно.
3. Установлено, что уровни белка S-100 и нейроспецифических альфа-глобулинов достоверно (p<0,01) повышаются в сыворотке пациентов с тяжелой ЧМТ пропорционально степени травмы. Определение органоспецифических альфа-глобулинов мозга и белка S-100 в сыворотках пациентов с тяжелой ЧМТ может применяться для оценки объема и степени повреждения ткани головного мозга.
4. Длительное (свыше 3-6 месяцев) повышенное содержание нейроспецифических альфа-глобулинов после ЧМТ характерно для поздних осложнений нейротравмы.
Рецензенты:
Николаев А.А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой бионеорганической химии, Астраханский государственный медицинский университет, г. Астрахань;
Сентюрова Л.Г., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой биологии, Астраханский государственный медицинский университет, г. Астрахань.