Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

НЕЙРОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ БЕЛКИ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ОЦЕНКЕ ОСЛОЖНЕНИЙ НЕЙРОТРАВМЫ

Коханов А.В. 1 Воронкова М.Ю. 1 Бисалиева Р.А. 1 Мяснянкин А.А. 1 Огнев П.В. 1
1 ГБОУ ВПО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России
Путем иммунизации кроликов экстрактами мозга человека, обработанными сульфосалициловой кислотой, насыщенным раствором сульфата аммония и кипячением, получены моноспецифические антитела к трем белкам мозга: двум нейроспецифическим альфа-глобулинам и белку S-100. Обнаруженные новые антигены мозга имеют молекулярные массы 139 (альфа1-ТС-глобулин) и 145 КДа (альфа2-КС-глобулин мозга). На очищенные нейробелки сконструированы два варианта иммунохимических тест-систем для иммунодиффузионного и иммуноферментного анализа. Установлено, что уровни белка S-100 и нейроспецифических альфа-глобулинов достоверно повышаются в сыворотке пациентов с тяжелой ЧМТ пропорционально объему и степени травмы, а также при развитии поздних неврологических осложнений после нейротравмы. Новые органоспецифические альфа-глобулины мозга могут представлять теоретический интерес для нейрохимии и иметь клиническое значение в диагностике патологии мозга.
нейроспецифические белки
термостабильные и кислотостабильные альфа-глобулины мозга
физико-химические свойства
иммуноферментный анализ
клиническое значение
диагностика поздних осложнений нейротравмы
1. Клиническое руководство по черепно-мозговой травме / Под ред. А.Н. Коновалова, Л.Б. Лихтермана, А.А. Потапова. – М.: Антидор, 1998. – 550 с
2. Коханов А.В. Возможность использования иммуносенсоров в ургентной медицине // Успехи современного естествознания. — 2005. — № 12. — С. 43–44.
3. Коханов А.В., Николаев А.А. Биохимические аспекты патологических изменений у больных с тяжелой черепно-мозговой травмой // Клин. лабор. диагностика. – 2007. – № 9. – С. 63.
4. Коханов А.В., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В., Мяснянкин А.А., Метелкина Е.В. Уровни железосодержащих белков крови и динамика рО2 в остром периоде черепно-мозговой травмы // Международный журнал экспериментального образования. – 2010. – № 11. – С. 93–94.
5. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Лабораторные методы диагностики неотложных состояний. – М.: Медицина, 2002. – 568 с
6. Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. – М.: Медицина, 1999. – 416 с.
7. Чишиева М.А., Мяснянкин А.А., Коханов А.В. Белки мозга с экстремальными физико-химическими параметрами: иммунохимическая идентификация и моделирование тест-систем // Астраханский медицинский журнал. – 2012. – № 1. – С. 93–96.
8. Bekhtereva N.P. El cerebro humano sano y enfermo. Buenos Aires-Barcelona-Mexico, Editorial Paidos, 1984. 235 p.
9. Grasso A., Roda G., et al. Preparation and properties of the brain specific protein 14-3-2 // Brain Res. — 1977. — Vol. 124. — Р. 497–507.
10. Moore B.W. A soluble protein characteristic of the nervous system // Biochem. biophys. Res. Commun. – 1965. – Vol. 19. – Р. 739–744.
Изучение антигенного состава такого важного органа человека, как головной мозг, и такой важной ткани, как нервная, представляет значительный интерес не только с точки зрения анализа структурной антигенной дифференцировки нервной ткани, но и, учитывая забарьерное расположение головного мозга, может иметь важное практическое значение в случае находок органоспецифических антигенов мозга в крови больных с травмами, нервно-психическими, воспалительными и опухолевыми заболеваниями центральной нервной системы [5, 6]. Подобные находки не только расширяют наши знания о природе данных заболеваний, но и имеют важное диагностическое значение. Кроме того, даже сама проблема идентификации тканевых антигенов нервной ткани представляет большой интерес вследствие функциональной важности подобных антигенов, могущих принимать участие в процессах «запоминания», миелинизации и аутоиммунных конфликтах [8].

К концу 1960-х гг. серологическими методами анализа было доказано наличие в составе головного мозга органоспецифических антигенов [6]. Наиболее известными представителями нейроспецифических белков являются белок S-100 [10], нейроспецифическая енолаза (NSE или антиген 14-3-2) [9], альфа-2-гликопротеин Варецкой (α2-GP) [7] и глиофибриллярный кислый антиген (GFAP) [6].

Совершенствование техники фракционирования белков, применение методов иммунохимического анализа значительно расширили наши знания об антигенном составе нервной ткани [2, 3]. Доказательством этого являются публикации в последние годы ряда обзоров и монографий, посвященных иммунохимической характеристике протеинов, специфических для центральной и периферической нервной системы [‎6], появление научного журнала «Нейрохимия».

Помимо вышеперечисленных нейробелков S-100, НСЕ (14-3-2), α2-GP и GFAP [6, 9, 10], в литературе имеются единичные описания кислых антигенов мозга: «А» и «Д», «а»-протеина, белков группы «В», антигенов «SPR», альфа «BASNT» и «SRANT», термостабильного спиртонерастворимого протеина, альфа2-мозгоспецифического антигена и целого ряда представителей «основных» белков головного мозга [7]. Отличительной особенностью всех этих идентифицированных нейробелков является то, что их молекулярные массы не превышают 50-60 КДа [‎6, 7].

Основная масса водорастворимых тканевых и сывороточных белков более высокой молекулярной массы денатурирует в экстремальных физико-химических условиях, для их выделения и очистки требуются достаточно мягкие физиологические условия фракционирования [7]. Однако существует небольшая группа водорастворимых белков, способных сохранять свои нативные свойства при жестких методах фракционирования (так, например, ферритин выдерживает длительное кипячение [4], эмбриональный преальбумин - обработку сильными органическими кислотами [2], фетальный гемоглобин - растворами щелочей [4], белок S-100 - насыщенными растворами сульфата аммония [10], альфа-фетопротеин - спиртовым раствором трихлоруксусной кислоты [7] и т.д.). Такие белки-«экстремалы» привлекают внимание биохимиков легкостью своего получения, особенностью своего строения, обеспечивающего уникальную стабильность макромолекулы и биологической функции, физиологов увлекают на поиск особенной биологической роли таких белков в патогенезе, а клиницистов - перспективой их клинического применения.

Все вышесказанное относится и к исследованиям нейроспецифических белков с подобными свойствами и их приложению к клиническим проблемам неврологии и нейрохирургии.

Цель исследования

Поиск новых нейроспецифических белков с экстремальными физико-химическими характеристиками и оценка значения иммунохимических тестов на эти нейробелки для диагностики и прогнозирования нейротравмы.

Материалы и методы

Биологический материал получали в бюро судебно-медицинской экспертизы г. Астрахани в виде аутопсийного материала мозга от лиц, погибших от случайных причин. К диализованным после центрифугирования продуктам фракционирования экстрактов дефинитивного мозга 10%-ной сульфосалициловой кислотой, насыщенным раствором сульфата аммония или термообработкой при 100°С × 10 мин получали антисыворотки путем иммунизации кроликов по общепринятым схемам с полным адьювандтом Фрейнда.

После абсорбции антисывороток сывороткой крови доноров и сухой плазмой, а также смесью экстрактов различных органов удалось получить моноспецифические антисыворотки к трем органоспецифическим антигенам мозга, аналогичным описанным в литературе нейроспецифическим антигенам: термостабильному антигену Каспари-Филда или к альфа1-BE-глобулин мозга [7], кислотостабильному антигену мозга, идентичному альфа-2-СС-глобулины мозга [7] и органоспецифическому белку мозга, растворимому в насыщенном сульфате аммония, иммунохимически идентифицированному как белок S-100 [10].

Моноспецифические тест-системы к альфа1- и альфа2-глобулинам мозга и белку S-100 были использованы нами для поиска их в составе сывороточных белков при травматической болезни мозга.

Тяжесть повреждения ЦНС при черепно-мозговых травмах (ЧМТ) различной степени тяжести оценивали по шкале ком Глазго (SCG) [1].

Пробы крови брали: из подключичной вены у больных в отделении реанимации и интенсивной терапии, из локтевой вены у доноров и больных нейрохирургических отделений в стандартных условиях при поступлении или натощак. Образцы сыворотки крови отбирали по 1,5 мл в две пластиковые пробирки «Эппендорф» для исследования и хранили при температуре -25°С до анализа. Кровь забирали на 1-3-е, 5-7-е и 14-19-е сутки после поступления больных в стационар. У части пациентов, перенесших ЧМТ и имевших поздние неврологические осложнения, повторно исследовали кровь в сроки от 3 месяцев до 1 года после нейротравмы.

Клинический материал представлен данными 142 больных мужского и женского пола в возрасте от 19 до 70 лет с изолированными закрытыми черепно-мозговыми травмами различной степени тяжести и 30 больных в возрасте от 23 до 66 лет, госпитализированных с последствиями и осложнениями ЧМТ. Диагноз ставили в соответствии с принятой единой классификацией острой ЧМТ [1]. Больные с ЧМТ условно были разделены на две группы.

В группу пациентов с легкой черепно-мозговой травмой (ЧМТ I) были включены больные с сотрясением головного мозга (СГМ) - 30 человек и ушибом головного мозга (УГМ) легкой степени - 22 человека. Средняя оценка по шкале комы Глазго на момент поступления в клинику составила 13,7±0,09 балла.

Группу с тяжелой черепно-мозговой травмой (ЧМТ II) составили 90 пациентов, из которых 41 пациент с УГМ средней степени тяжести и 49 с тяжелым УГМ и сдавлением головного мозга. Средняя оценка по шкале комы Глазго на момент поступления в клинику составила 8,0±0,19 и колебалась от 11 до 5-4 баллов.

30 пациентов, перенесших ЧМТ и имевших клинические признаки поздних осложнений ЧМТ, составили группу ПО ЧМТ.

Контролем служили 68 образцов сывороток крови доноров обоего пола в возрасте от 30 до 56 лет, полученных из областной станции переливания крови. Общее количество образцов сыворотки крови от 172 пациентов и 68 доноров составило 620 проб.

Полученные результаты подвергались статистической обработке с вычислением средних величин и их ошибок (М ± m), достоверными считались различия при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Сравнительный анализ физико-химических свойств выявленных органоспецифических и межорганных антигенов мозга показал, что нами идентифицированы два новых органоспецифических антигена мозга с отличающимися характеристиками от общеизвестных белков мозга и получена собственная иммунохимическая тест-система на хорошо изученный белок S-100.

Один из нейроспецифических альфа1-глобулин мозга обладает свойством термостабильности (поэтому назван нами альфа1-ТС-глобулин), обратимо осаждается этакридином и сульфатом аммония, необратимо - трихлоруксусной и сульфосалициловой кислотами. Второй обнаруженный нами органоспецифический альфа1-глобулин мозга - кислотостабильный, растворим в хлорной или сульфосалициловой кислоте (назван нами альфа2-КС-глобулином).

Сравнение физико-химических параметров выделенных альфа1- и альфа2-глобулинов мозга с параметрами наиболее известных нейроспецифических белков позволяет заключить, что они не идентичны им, так как молекулярные массы ранее описанных нейроспецифических белков не превышают 40-50 КДа [‎7], а обнаруженные нами антигены мозга имеют молекулярные массы 139 (альфа1-ТС-глобулин) и 145 КДа (альфа2-КС-глобулин мозга).

На очищенные нейробелки альфа1-ТС-глобулин, альфа2-КС-глобулин сконструированы два варианта иммунохимических тест-систем. Чувствительность ИФА тест-систем составила: для α1-ТС-глобулина мозга 5 нг/мл, для α2-КС-глобулина мозга - 10 нг/мл; ИДА тест-систем - 2 мг/л и 5 мг/л соответственно. Верификацию моноспецифических тест-систем проводили с референтными наборами на эти антигены из банка тест-систем кафедры биохимии Астраханского ГМУ.

Исследование содержания двух новых белков мозга в сопоставлении с нейробелком S-100 в сыворотках крови у пострадавших с ЧМТ выявило следующие закономерности (табл. 1). У пациентов с ЧМТ легкой степени в первые 1-3 дня после травмы ни один из трех исследованных нейробелков достоверно не повышен по сравнению с их уровнем в крови доноров. В эти же сроки после ЧМТ тяжелой степени (ЧМТ II) в крови пострадавших в достоверно повышенных количествах обнаруживался только один из трех нейробелков -  мозгоспецифический глиальный антиген S-100 (p<0,001). На 5-7-й день достоверно повышенные концентрации S-100 наблюдали у пострадавших ЧМТ любой степени тяжести (различия по сравнению с контролем достоверны при p<0,05 для группы ЧМТ I и при p<0,001 для групп ЧМТ II).

На 2-3-й неделе сывороточная концентрация белка S-100 быстро снижалась практически до нормы (табл. 1). Однако у пациентов с поздними неврологическими осложнениями ЧМТ (группа ПО ЧМТ) концентрация белка S-100 была достоверно повышена на 50% по сравнению с донорским уровнем этого белка (p<0,001).

В отличие от белка S-100 уровни двух других органоспецифических белков мозга достоверно не повышались при легкой ЧМТ и медленно нарастали в первые три дня тяжелой травмы мозга. α1-ТС-глобулин имел пик в крови больных с тяжелой ЧМТ (ЧМТ II) на 5-7-е сутки с последующим снижением его уровня. Наоборот, статистически значимый повышенный уровень α2-КС-глобулина на 5-7-й день тяжелой ЧМТ продолжал повышаться к 14-19-м суткам (табл. 1).

При отсутствии осложнений ЧМТ уровни всех трех нейробелков в сроки наблюдения от 3 месяцев до 1 года не отличались от контрольных донорских значений. Наоборот, в отдаленные сроки после ЧМТ (90-180 суток) при развитии у пациентов различных поздних неврологических осложнений (группа ПО ЧМТ) концентрации в крови всех трех исследованных нейробелков были достоверно повышены (p<0,001): белка S-100 в 1,5 раза по сравнению с донорским уровнем этого белка, α1-ТС-глобулина - в 2,4 раза и α2-КС-глобулина - в 2,1 раза.

Обнаруженные новые органоспецифические альфа-глобулины мозга могут представлять теоретический интерес для нейрохимии и иметь клиническое значение в диагностике патологии мозга.

Таблица 1

Динамика уровней органоспецифических белков мозга в крови у пациентов с легкой и тяжелой ЧМТ при поступлении и в период поздних осложнений (ПО ЧМТ)

Показатели

Срок после травмы

ЧМТ I

(n=52)

ЧМТ II

(n=90)

ПО ЧМТ

 (n=30)

доноры

(n=68)

S-100 (нг/мл)

1-3-и сутки

5-7-е сутки

14-19-е сутки

0,7±0,18

0,9±0,24*

0,5±0,16

1,2±0,20*

1,3±0,18*

0,5±0,15

 

0,6±0,08*

 

 

0,4±0,05

 

α1-ТС-глобулин  (нг/мл)

1-3-и сутки

5-7-е сутки

14-19-е сутки

42±12

33±11

45±13

47±19

88±20*

59±13

 

104±11*

 

 

44±17

 

α2-КС-глобулин (нг/мл)

1-3-и сутки

5-7-е сутки

14-19-е сутки

111±41

122±52

105±47

106±28

203±30*

247±29*

 

233±41*

 

 

110±33

 

Примечание: * различия с контрольной группой доноров статистически значимы (р<0,05).

Выводы

1. В экстрактах дефинитивного мозга с помощью кроличьих антисывороток обнаружены три органоспецифических антигена с подвижностью альфа-глобулинов: альфа1-ТС-глобулин мозга (выдерживает термообработку кипячением, идентичен по физико-химическим свойствам ранее описанному антигену Каспари-Филда), альфа2-КС-глобулин мозга (растворим в сульфосалициловой и хлорной кислотах) и белок S-100.

2. На очищенные антигены мозга альфа1-ТС-глобулин, альфа2-КС-глобулин получены моноспецифические антисыворотки и сконструированы два варианта иммунохимических тест-систем. Чувствительность ИФА тест-систем составила: для α1-ТС-глобулина мозга 5 нг/мл, для α2-КС-глобулина мозга - 10 нг/мл; ИДА тест-систем - 2 мг/л и 5 мг/л соответственно.

3. Установлено, что уровни белка S-100 и нейроспецифических альфа-глобулинов достоверно (p<0,01) повышаются в сыворотке пациентов с тяжелой ЧМТ пропорционально степени травмы. Определение органоспецифических альфа-глобулинов мозга и белка S-100 в сыворотках пациентов с тяжелой ЧМТ может применяться для оценки объема и степени повреждения ткани головного мозга.

4. Длительное (свыше 3-6 месяцев) повышенное содержание нейроспецифических альфа-глобулинов после ЧМТ характерно для поздних осложнений нейротравмы.

Рецензенты:

Николаев А.А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой бионеорганической химии, Астраханский государственный медицинский университет, г. Астрахань;

Сентюрова Л.Г., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой биологии, Астраханский государственный медицинский университет, г. Астрахань.


Библиографическая ссылка

Коханов А.В., Воронкова М.Ю., Бисалиева Р.А., Мяснянкин А.А., Огнев П.В. НЕЙРОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ БЕЛКИ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ОЦЕНКЕ ОСЛОЖНЕНИЙ НЕЙРОТРАВМЫ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=21789 (дата обращения: 22.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074