Цель исследования
Целью работы явилось изучение потенциальной флоготропной (про- или противовоспалительной) активности н-гексадецилтрифенилфосфония бромида при наружном применении в форме мази.
Материалы и методы
Технология получения мазей н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида. Мази н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида изготавливали на основе вазелина в концентрациях 0,05% и 0,25% — перемешиванием биологически активного соединения (без предварительного измельчения) с основой при температуре 40 °С. Н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид растворяется в основе, образуя однородную мазь-раствор.
Исследование противовоспалительной активности. Эксперименты были проведены на 24 лабораторных беспородных крысах (самцах) массой 320±33 г. Подопытных животных содержали в условиях вивария (с естественным режимом освещения; при температуре 22–24oC; относительной влажности воздуха 40–50%) с использованием стандартной диеты (ГОСТ Р 50258-92) [3]. Исследования проводили в соответствии с правилами качественной лабораторной практики (GLP) при проведении доклинических исследований в РФ, а также правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1986) [4].
Каррагениновый отек лап крыс вызывали субплантарным введением (под подошвенный апоневроз) в заднюю правую лапу крыс 0,1 мл 1%-ного водного геля каррагенина [6], который готовили перед введением. Выраженность отека оценивали путем измерения объема лапы животных с помощью плетизмометра 37140 (Ugo Basile, Италия). Измерения производили до индукции отека (исходный объем), через 1, 2, 3, 4 и 24 ч после подподошвенного введения каррагенина, а далее 1 раз в день в течение 13 дней. Лапу животных погружали в камеру плетизмометра до тибиотарзального сустава.
О противовоспалительной активности исследуемых соединений судили по уменьшению прироста объема лапы, выраженного в процентах к исходному объему по сравнению с группой контроля.
Объем лапы животного до введения каррагенина считали исходным и принимали за 100%.
% прироста объема лапы = [(объем после введения каррагенина в соответствующий момент времени – исходный объем) / исходный объем] *100.
Подопытные животные были разделены на 4 группы по 6 крыс, которым наносили мази на лапу 1 раз в сутки в течение 13 дней:
группа 1: контроль – вазелин;
группа 2: препарат сравнения — Тридерм® (Шеринг-Плау лабо Н.В., мазь) для наружного применения, содержащая в 1 г: бетаметазон 0,5 мг (в виде бетаметазона дипропионата 0,64 мг), клотримазол 10 мг, гентамицин 1 мг (1000 МЕ) [5];
группа 3: 0,05%-ная мазь н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида;
группа 4: 0,25%-ная мазь н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Microsoft Office Excel 2010 с вычислением средней арифметической М, ее стандартного отклонения δ и стандартной ошибки m. Для оценки достоверности различий выборок, имеющих нормальное распределение, применяли параметрический t-критерий Стьюдента. За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95 % и более (p ≤ 0,05).
Для
максимально точной оценки интенсивности моделированной каррагенином
воспалительной реакции и потенциального флоготропного действия разрабатываемых
мазей рассчитывали площадь под кривой «Прирост объема лап – время» следующим
образом. Вычисляли
площадь под кривой с помощью стандартного метода численного интегрирования –
метода трапеций, где площадь криволинейной трапеции заменяется площадью
многоугольника, составленного из N трапеций, при этом кривая заменяется
вписанной в нее ломаной. На каждом из частичных отрезков функция
аппроксимируется прямой, проходящей через конечные значения, при этом площадь
трапеции на каждом отрезке определяется по формуле : 
Высота
трапеций составляет небольшую величину, соответствующую отрезку
При этом площадь под графиком функции можно
вычислить как сумму площадей составляющих прямоугольных трапеций.
Результаты и обсуждение
Каррагениновый отек лап крыс
Воспалительная реакция, вызванная субплантарным введением 1%-ного геля каррагенина, развивалась в виде отека с увеличением объема лап крыс на 16–24 % от исходного объема. Максимальное развитие отека наблюдалось у животных контрольной группы через 3 ч после введения каррагенина, что соответствует литературным данным о развитии каррагенинового отека лап крыс [8, 9]. Тридерм проявил противовоспалительную активность на сроке 3 и 4 ч после введения каррагенина с подавлением отека на 62 % (р = 0,02). На сроке 4 ч после индукции отека наружное введение мази тридерма способствовало подавлению отека лап крыс на 57 % (р = 0,02). На 3-е, 4-е, 5-е, 6-е и 7-е сутки (через 48, 72, 96, 120 и 144 ч после введения каррагенина) противовоспалительное действие тридерма проявилось в виде подавления отека лап крыс на 79, 80, 79, 85 и 95% (р= 0,002; 0,01; 0,01; 0,02 и 0,05) соответственно. На 7-й день эксперимента отек лап крыс под действием тридерма полностью исчезал.
Мази н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида в концентрации 0,05% и 0,25% не проявили противовоспалительную активность в условиях эксперимента (таблица 1).
Таблица 1
Процент прироста объемов лап крыс на различных сроках после моделирования острого каррагенинового отека на фоне лечения мазью Тридерм, 0,05%-ной и 0,25%-ной мазями н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида М±m (δ), Т-тест
|
|
Группа-1 Контроль |
Группа-2 Тридерм |
Группа-3 Мазь 0,05% |
Группа-4 Мазь 0,25% |
|||||
|
М±m (δ) |
Ттест |
М±m (δ) |
Ттест |
М±m (δ) |
Ттест |
||||
|
1 ч |
16,3±3,5 (8,6) |
9,2±2,3 (5,8) |
0,07
|
12,5±3,7 (9,7) |
0,24 |
9,0±3,0 (6,7) |
0,07 |
||
|
2 ч |
21,3±5,2 (12,7) |
14,0±3,2 (7,8) |
0,14 |
16,0±5,0 (13,4) |
0,25
|
16,9±3,2 (7,1) |
0,24 |
||
|
3 ч |
24,2±5,1 (12,4) |
9,0±2,5 (6,1) |
0,02 |
23,1±6,0 (15,9) |
0,45 |
27,8±1,9 (4,3) |
0,26 |
||
|
4 ч |
22,6±4,9 (12,1) |
9,7±3,2 (7,8) |
0,03 |
25,5±6,0 (15,8) |
0,37 |
33,1±5,5 (12,4) |
0,10 |
||
|
24 ч |
19,6±6,3 (15,3) |
9,2±1,6 (3,9) |
0,08 |
23,8±4,1 (11,0) |
0,30 |
30,1±1,5 (3,4) |
0,08 |
||
|
48 ч |
21,2±4,2 (10,2) |
4,5±1,9 (4,6) |
0,004 |
26,7±2,6 (6,8) |
0,15 |
24,7±4,6 (10,4) |
0,29 |
||
|
72 ч |
15,7±3,9 (9,7) |
3,1±1,2 (3,0) |
0,01 |
20,8±2,7 (7,2) |
0,16 |
19,4±4,5 (10,0) |
0,27 |
||
|
96ч |
10,4±2,6 (6,4) |
2,1±1,4 (3,4) |
0,01 |
15,3±1,3 (3,4) |
0,07 |
12,3±3,3 (7,3) |
0,22 |
||
|
120ч |
8,0±3,0 (7,5) |
0 |
|
6,8±2,9 (7,6) |
0,39 |
12,4±1,4 (3,1) |
0,15 |
||
|
144ч |
4,6±2,2 (5,4) |
0 |
|
8,4±2,9 (7,8) |
0,18 |
6,7±2,1 (4,7) |
0,25 |
||
|
168ч |
4,0±1,9 (4,7) |
0 |
|
4,8±2,4 (6,3) |
0,40 |
2,1±1,9 (4,4) |
0,26 |
||
|
192ч |
3,1±1,5 (3,7) |
0 |
|
1,7±0,9 (2,4) |
0,23 |
0,8±0,6 (1,4) |
0,10 |
||
|
264ч |
0 |
0 |
|
0 |
|
0 |
|
||
— Т-тест по сравнению с контрольной группой (0,05 г вазелин).
Однако при использовании 0,25%-ной мази н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида замечена тенденция к усилению величины
воспалительного отека лап крыс, вызванного субплантарным введением 1%-ного
водного геля каррагенина (рис. 1).
Рис. 1. Процент прироста объема лап крыс, вызванного субплантарным введением каррагенина, на фоне наружного лечебно-профилактического введения мази тридерма, мази н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида 0,05% и мази н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида 0,25%.
«Провоспалительный» эффект при увеличении концентрации н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида в мази может быть обусловлен тем, что н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид является амфифильным детергентом, работающим как в водной, так и жировой фазе и вследствие этого — пенетрирующим агентом, проникающим через биомембраны [2], что может способствовать глубокому проникновению каррагенина в ткани и тем самым — усилению воспаления.
При вычислении площади под кривой «Прирост объема лап – время» мы не обнаружили различий в показателях контрольной группы и групп животных, которым использовали мази н-гексадецилтрифенилфосфония бромида, что позволяет нам делать заключение об отсутствии местно-раздражающих и истинно провоспалительных свойств у этого соединения (табл. 2 и рис. 2).
Таблица 2
Площади под кривой «Прирост объема лап – время» при моделировании отека у крыс субплантарным введением каррагенина, на фоне наружного лечебного применения мазей н-гексадецилтрифенилфосфония бромида и тридерма
|
№ п/п |
Группы |
Площади под кривой «Прирост объема лап – время» (М±δ) |
|
1 |
Контроль |
1845,4±973,6 |
|
2 |
Тридерм |
494,9 ± 277,1 |
|
3 |
Мазь 0,05% |
2293,5 ± 770,7 |
|
4 |
Мазь 0,25% |
2250,3 ± 592,0 |
Рис. 2. Площади под кривой «Прирост объема лап – время» при моделировании отека у крыс субплантарным введением каррагенина, на фоне наружного лечебного применения мазей н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида и Тридерм
Выводы
Н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид при наружном лечебном применении в течение 13 дней в форме мази (0,05% и 0,25%) на лапы крыс с моделированным каррагениновым отеком не оказывает флоготропного (ни противовоспалительного, ни провоспалительного) действия.
Рецензенты:Зиганшин А.У., д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии фармацевтического факультета КГМУ, г. Казань;
Альберт А.Р., д.б.н., профессор, кафедра генетики, института фундаментальной медициы и биологии, КФУ, г. Казань.