Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

DETECTION OF CIRCULATING TUMOR CELLS IN THE BLOOD AND THEIR CORRELATION WITH IMMUNOCOMPETENT CELLS IN PATIENTS WITH GENERALIZED LUNG CANCER

Bakhtin A.V. 1 Kit O.I. 1 Novikova I.A. 1 Zlatnik E.Yu. 1 Isaeva R.G. 1 Selyutina O.N. 1 Shulgina O.G. 1
1 Rostov Research Institute of Oncology
20 patients with stage IV lung cancer were examined using CellSearch™ system in order to detect CTCs and determine their interrelation with immune status parameters. CTC detection in patients with NSCLC was 91% and with SCLC – 66.7%. CTC level corresponded to the low values in 80% in NSCLC. NSCLC patients with a high CTC level were not found. High CTC values prevailed in SCLC patients (66.6%). A high CTC level was characterized by a significantly low relative content of CD3+CD4+ lymphocytes in comparison with the values in patients with a low and average CTC levels, and by significantly high content of T-reg and CD19+ lymphocytes in comparison with the values in patients with an average CTC level. Negative correlation was observed between levels of CTCs and CD3+CD4+ cells and between CTCs and immunoregulatory index; positive correlation - between levels of CTCs and CD3+CD8+CD38+ cells. Level of CTCs was found to have correlation with minor subpopulations of lymphocytes: CD3+CD4+CD25+ and CD3+CD4+CD8+, CD3+CD8+CD25+ and CD3+CD16/56+.
small cell lung cancer (SCLC)
non-small cell lung cancer (NSCLC)
circulating tumor cells (CTCs)
immunocompetent cells
Взаимодействие опухоли и организма опухоленосителя является одной из важнейших фундаментальных проблем онкологии. Очевидно, что, несмотря на многочисленные барьерные и защитные механизмы, включая иммунные, опухоль растет и метастазирует. Среди сложных механизмов этого процесса, имеющих особенности в зависимости от локализации, гистологического строения, пролиферативных характеристик, иммунофенотипа, молекулярно-биологических и других особенностей опухоли, представляются важными те, которые действуют на этапе циркуляции опухолевых клеток в крови, где они находятся в окружении иммунокомпетентных клеток.

Детекция ЦОК в крови больных представляет собой вариант «жидкостной биопсии», позволяющей в ранние сроки предсказывать возникновение рецидива заболевания, прогнозировать течение болезни, осуществлять мониторинг эффективности терапии. Количество ЦОК используют как независимый высокоспецифичный прогностический фактор при раке молочной железы [8] (), простаты [9] и толстой кишки [7]. Обнаружение ЦОК в крови больных раком молочной железы, предстательной железы и толстой кишки может служить не только маркером распространенности опухолевого процесса и оценки эффективности проводимого лечения, но и индикатором активности опухолевого процесса и его стабилизации, даже при наличии дистантных метастазов [3].

Первой системой для непосредственного определения ЦОК в крови пациентов стала система CellSearchTM (Janssen Diagnostics, Inc.), которая утверждена для применения при трёх локализациях злокачественных опухолей: раке молочной железы, простаты и толстой кишки. Поскольку принцип работы системы CellSearchTM связан с наличием на поверхности ЦОК маркеров  адгезии эпителиальных клеток EpCAM и цитокератинов 8,18,19, можно ожидать успешной детекции всех опухолевых клеток, несущих данные молекулы (гландулярный эпителий пищеварительного, респираторного, урогенитального тракта; эндокринные и экзокринные клетки, мезотелий).

Интерес исследователей к РЛ закономерен: он занимает лидирующее место в смертности от онкологического заболевания по всему миру [10], а пятилетняя выживаемость составляет менее 5 и 15 % для мелкоклеточного (МРЛ) и немелкоклеточного (НМРЛ) рака лёгкого соответственно [6] [5].

В последние годы доказано, что в  процессе опухолевого роста нередко развиваются механизмы, обеспечивающие «ускользание» опухолевых клеток от надзора со стороны иммунной системы [2]. Хотя антигены опухолевых клеток и распознаются иммунной системой, элиминация их происходит не всегда, так как механизмы, направленные на уничтожение опухолевых клеток, могут играть противоположную роль, способствуя ее сохранению и прогрессии [1]. Кроме того, опухоль по своему составу гетерогенна, что создает предпосылки для естественного отбора определенных клеточных клонов, наиболее приспособленных к окружающим условиям [4]. Поиск механизмов, влияющих на диссеминацию опухолевых клеток в кровяном русле, важен как для снижения вероятности возможного прогрессирования, так и для определения новых прогностических факторов, а понимание участников и процессов, вовлеченных в метастазирование, может привести к эффективным, целевым подходам в его лечении и профилактике.

Цель исследования. Оценить частоту выявления ЦОК при генерализованных формах рака легкого, а также их взаимоотношение с иммунокомпетентными клетками крови.

Материалы и методы исследования: Исследование проведено 20 больным раком легкого IV стадией заболевания (Т2-3N2-3M1) в возрасте от 52 до 75 лет.  У 11 человек (55 %) гистологический тип опухоли соответствовал немелкоклеточному раку, у 9 (45 %) -  мелкоклеточному. Анализ образцов крови на наличие ЦОК осуществляли на системе CellSearch с использованием набора реагентов CELLSEARCH® CTC Kit. Число выявленных ЦОК являлось конечным результатом. По количеству  ЦОК больные были разделены на группы с низким количеством (до 10) ЦОК, со средним (от 11 до 100) ЦОК, и высоким (cвыше 100) ЦОК. Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов определяли на проточном цитометре BD FACSCantoII. Протоколы интерпретации данных включали определение основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови, количества Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+CD127dim), NKT-клеток, двойных негативных CD3+/CD4-/CD8- (DN) и двойных позитивных CD3+/CD4+/CD8+ (DP) T-лимфоцитов, количества активационных маркеров (CD25, CD38, CD95, HLADR) на Т-хелперах (CD3+СD4+) и ЦТЛ (CD3+СD8+). Результаты выражали в процентах от общего количества лимфоцитов, а для T-регуляторных клеток в процентах от CD3+CD4+ клеток. Статистический и корреляционный анализ результатов исследования проводили с помощью программы STATISTICA 7.0 (StatSoft Inc., США), статистически достоверные различия принимали при р<0,05; при коэффициенте корреляции (r) от 0,91 до 1,00 теснота связи определялась как очень сильная, от 0,81 до 0,90 - весьма сильная, от 0,65 до 0,80 - сильная, от 0,45 до 0,64 - умеренная, от 0,25 до 0,44 - слабая, до 0,25 - очень слабая.

Результаты и обсуждение

ЦОК были выявлены у 16 из 20 больных раком легкого (80 %) в количестве от 1 до 980 клеток в 7,5 мл крови, при НМРЛ у 10 из 11 (в 91 %), при МРЛ у 6 из 9 человек (в 66,7 %). Доля больных раком легкого с количеством ЦОК от 1 до 10 клеток составила 50 % (8 из 16 больных), с уровнем ЦОК от 11 до 100 и свыше 100 клеток, по 25 % (4 из 16 больных). При МРЛ количество ЦОК находилось в пределах от 1 до 980, тогда как при НМРЛ от 1 до 13 клеток. Среди больных МРЛ с выявленными ЦОК преобладали те, у кого количество превышало 100 клеток (в 66,6 % случаев, у 4 из 6 больных), тогда как с наименьшим и средним количеством ЦОК их отмечалось по 16,7 % (по 1 из 6 больных для каждой группы). У больных НМРЛ нами выявлена обратная закономерность. В этой группе у 80 % больных (у 8 из 10) уровень ЦОК соответствовал низким и у 20 % (у 2 из 10) средним значениям. Больные с высокими значениями ЦОК среди НМРЛ отсутствовали.

Сравнение показателей клеточного иммунитета у больных РЛ при обнаружении у них различного количества ЦОК показало ряд статистически значимых различий, несмотря на немногочисленность наблюдений. Так, из табл.1 видно, что при высоком уровне ЦОК отмечено достоверно более низкое процентное содержание CD3+CD4+ лимфоцитов по сравнению с показателями больных, у которых ЦОК были обнаружены в количествах до 100. Противоположные различия отмечены для CD3+CD8+CD38+, хотя по общей субпопуляции CD3+CD8+ лимфоцитов они не установлены. Как видно из табл.1, уровень лимфоцитов с иммунофенотипом активированных цитотоксических Т-клеток статистически достоверно (в 2-3 раза) выше у больных с максимальным содержанием ЦОК по сравнению с остальными группами. Обращают на себя внимание более низкие значения ряда показателей у больных со средними значениями уровней ЦОК, однако, статистически достоверные различия выявлены только для В-лимфоцитов, относительное содержание которых в 3 раза ниже, чем в остальных группах, а также для Т-regs, количество которых было в 2 раза ниже, чем у больных с высоким содержанием ЦОК. При этом у больных со средними уровнями ЦОК обнаружено более высокое содержание Т-лимфоцитов обеих основных субпопуляций с маркерами поздней активации CD3+CD4+HLA-DR+ и CD3+CD8+HLA-DR+, которое вследствие значительной индивидуальной вариабельности определялось в виде тенденции. Результаты относительного содержания иммунологических параметров в зависимости от количества выявленных ЦОК представлены в табл.1.                   

Таблица 1

Показатели иммунного статуса больных раком легкого в исследуемых группах, %

Исследуемые иммунологические параметры

Количество выявленных ЦОК

˂10 ЦОК

11˂ЦОК˂100

˃100 ЦОК

CD3+

70,94±7,84

81,6±10,89

70,7±15,12

CD3+/CD4+

42,24±4,55

44,7±2,55

28,95±3,75 *↓°↓

T-reg (от CD4)

8,3±3,76

5,2±2,12

10,3±1,13 °↑

CD3+/CD4+/CD38+

33,66±9,95

27,8±22,77

29,1±4,1

CD3+/CD4+/HLA-DR+

7,82±0,7

17,7±5,23

9,95±0,21

CD3+/CD4+/CD25+

5,26±0,71

3,55±1,77

8,05±5,59

CD3+/CD4+/CD95+

71,76±6,41

77,45±23,55

78,45±2,33

CD3+/CD8+

25,28±8,25

32,4±10,32

35,5±14,71

CD3+/CD8+/CD38+

17,1±6,39

11,65±3,04

30,65±2,9 *↑ °↑

CD3+/CD8+/HLA-DR+

25,38±10,25

33,3±4,67

21,65±9,83

CD3+/CD8+/CD25+

3,72±1,93

4,2±3,54

5,4±5,8

CD3+/CD8+/CD95+

84,42±5,28

86,3±2,26

86,0±5,37

CD(16+56)+

16,08±9,68

13,5±10,61

16,8±15,27

CD3+/CD(16+56)+

5,58±1,1

5,65±1,2

14,95±10,39

CD19+

11,86±4,46

3,75±0,92 *↓

11,2±1,27 °↑

CD3+/CD4-/CD8-

2,25±1,2

3,65±3,61

3,1±0,85

CD3+/CD4+/CD8+

0,64±0,19

1,5±1,56

2,3±2,83

ИРИ

1,84±0,59

1,5±0,57

0,9±0,28

 Примечание.* - разница показателей достоверна по отношению к группе  с количеством до 10 ЦОК (p≤0,05).

° -  разница показателей достоверна по отношению к группе с количеством от 11 до 100 ЦОК (p≤0,05).

При проведении корреляционного анализа наличия в крови больных ЦОК и иммунологическими параметрами выявлена сильная отрицательная корреляционная связь (r -0,87) между присутствием в крови ЦОК и CD3+CD4+ клеток. Подобная закономерность наблюдается и для ИРИ (r -0,53). Сильная положительная корреляция (r 0,78) обнаружена между лимфоцитами с иммунофенотипом активированных цитотоксических Т-клеток и наличием ЦОК. Результаты корреляционного анализа связи иммунологических параметров и наличия  ЦОК представлены в табл. 2.

Таблица 2

Корреляционная связь исследуемых иммунологических параметров и ЦОК

Исследуемые иммунологические параметры

ЦОК

CD3+

-0,30

CD3+/CD4+

-0,87

T-reg (от CD4)

0,39

CD3+/CD4+/CD38+

-0,08

CD3+/CD4+/HLA-DR+

-0,05

CD3+/CD4+/CD25+

0,74

CD3+/CD4+/CD95+

0,20

CD3+/CD8+

0,19

CD3+/CD8+/CD38+

0,78

CD3+/CD8+/HLA-DR+

-0,14

CD3+/CD4+/CD25+

0,45

CD3+/CD4+/CD95+

-0,04

CD(16+56)+

0,24

CD3+/CD(16+56)+

0,49

CD19+

0,10

CD3+/CD4-/CD8-

0,02

CD3+/CD4+/CD8+

0,67

ИРИ

-0,53

Как видно из табл. 2, уровень ЦОК демонстрирует сильную корреляционную связь с некоторыми минорными субпопуляциями лимфоцитов: CD3+CD4+CD25+ (r 0,74) и CD3+CD4+CD8+ (r 0,67), при этом показана умеренная корреляция с CD3+CD8+CD25+ (r 0,45) и CD3+CD16/56+, т.е. NKT (r 0,49). Последнюю можно рассматривать как артефакт, т.к. высокий процент NKT-клеток был, вероятно, компенсаторным при низком уровне NK лимфоцитов и обнаружен только у 1 больного, у которого при этом определялось высокое количество ЦОК.

Заключение

Таким образом, проведенное исследование с использованием системы CellSearch показало высокую частоту выявления ЦОК у больных раком легкого. У больных НМРЛ в 1,4 раза чаще выявлялись опухолевые клетки в крови, в сравнении с МРЛ, при этом при НМРЛ преобладающим являлся низкий уровень ЦОК, тогда как при МРЛ - высокий. Высокий уровень ЦОК характеризовался достоверно более низким относительным содержанием CD3+CD4+ лимфоцитов, а также достоверно высоким содержанием T-reg и CD19+ лимфоцитов. Количество Тregs клеток, с которыми, по современным представлениям, связана иммунодепрессия и прогрессирование опухоли, не продемонстрировали ни статистически достоверных различий, ни корреляций с наличием ЦОК, однако, выявленная положительная корреляционная связь последнего с долей лимфоцитов, экспрессирующих CD4+CD25+, позволяет предположить участие Тregs в процессе гематогенного метастазирования, тем более, что она выявлена на фоне отрицательной корреляции с общим количеством лимфоцитов Т-хелперно-индукторной субпопуляции (CD3+CD4+).  У больных с высокими значениями ЦОК выявленная положительная корреляция уровней DP (CD3+CD4+CD8+) лимфоцитов и ЦОК, по-видимому, связана с увеличением выброса незрелых клеток из тимуса, возможно, компенсаторным. Этим же можно объяснить и повышение уровня CD3+CD8+CD38+ клеток, однако, то обстоятельство, что подобные изменения не распространяются на лимфоциты с фенотипом CD3+CD4+CD38+, говорит о нарушении Т-хелперного звена еще на уровне посттимических предшественников. Полученные нами результаты о повышении содержания клеток этой субпопуляции на фоне высокого уровня ЦОК в целом соответствуют представлениям об их негативной роли при распространенных опухолевых процессах. Несмотря на полученные данные, исследования, направленные на определение уровня ЦОК в сочетании с детальной оценкой иммунного статуса для расширения представлений о механизмах метастазирования, и как следствие, поиска подходов для их профилактики, должны быть продолжены.

Рецензенты:

Шихлярова А.И., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изыскания новых противоопухолевых средств ФГБУ «РНИОИ» Минздрава РФ, г. Ростов-на-Дону;

Николаева Н.В., д.м.н., ассистент кафедры онкологии   ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава РФ, г. Ростов-на-Дону.