Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ДЕТЕКЦИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КРОВИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК И ИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЕ С ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ У БОЛЬНЫХ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМИ ФОРМАМИ РАКА ЛЕГКОГО

Бахтин А.В. 1 Кит О.И. 1 Новикова И.А. 1 Златник Е.Ю. 1 Исаева Р.Г. 1 Селютина О.Н. 1 Шульгина О.Г. 1
1 ФГБУ “Ростовский научно-исследовательский онкологический институт” Минздрава России
20 больным раком легкого IV стадии с использованием системы CellSearch™ проведено исследование, направленное на обнаружение ЦОК, и определена взаимосвязь их с параметрами иммунного статуса. У больных НМРЛ частота выявления ЦОК составила 91%, при МРЛ 66,7%. При НМРЛ в 80% уровень ЦОК соответствовал низким значениям. Больных НМРЛ с высоким уровнем ЦОК выявлено не было. При МРЛ преобладали больные с высокими значениями ЦОК (66,6 %). Высокий уровень ЦОК характеризовался достоверно более низким относительным содержанием CD3+CD4+ лимфоцитов, в сравнении со значениями больных с низким и средним уровнем ЦОК, а также достоверно высоким содержанием T-reg и CD19+ лимфоцитов в сравнении с показателями больных со средним уровнем ЦОК. Отрицательная корреляционная связь выявлена между уровнями ЦОК и CD3+CD4+ клеток, уровнем ЦОК и ИРИ; положительная корреляционная связь между уровнями ЦОК и CD3+CD8+CD38+ клеток. Уровень ЦОК продемонстрировал корреляционную связь с минорными субпопуляциями лимфоцитов: CD3+CD4+CD25+ и CD3+CD4+CD8+, CD3+CD8+CD25+ и CD3+CD16/56+.
мелкоклеточный рак легкого (МРЛ)
немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ)
циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК)
иммунокомпетентные клетки
1. Абелев Г.И., Эрайзер Т.Л. На пути к пониманию природы рака // Биохимия. – 2008. – Т.73, № 5. – С. 605–618.
2. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. – 3-е изд., доп. – К.: ООО «Полиграф плюс», 2006. – 482 с.
3. Кит О.И., Новикова И.А., Бахтин А.В. и др. Первый опыт детекции циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови // Международный журнал экспериментального образования. – 2013. – № 11. – С. 37-39.
4. Соснина А.В., Великая Н.В., Вараксин Н.А. и др. Роль цитокинов в патогенезе злокачественных новообразований. – Новосибирск: ЗАО ИПП «Офсет», 2014. – 128 с.
5. Anthony J. Alberg. Epidemiology of Lung Cancer: Diagnosis and Management of Lung Cancer, 3rd ed: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines / J. Alberg Anthony, V. Brock Malcolm, G. Jean et al. // CHEST. – 2013. Vol.5, № 143(Suppl). – P. e1S–e29S.
6. Tognela A. et al. Predictive and prognostic value of circulating tumor cell detection in lungcancer: A clinician’s perspective/ Critical Reviews in Oncology / A. Tognela et al. // Hematology. – 2015. – № 93. – Р. 90–102.
7. Cohen S.J. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer / S.J.Cohen, C.J. Punt, N. Iannotti et al. // J Clin Oncol. – 2008. – Vol.19, № 26. – P. 3213-21.
8. Cristofanilli M. M.D. Circulating Tumor Cells, Disease Progression, and Survival in Metastatic Breast Cancer / M. M.D. Cristofanilli, G.T. Budd , M.J. Ellis et al. // N Engl J Med. – 2004, № 351. – P. 781-91.
9. De Bono J.S. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer / J.S. De Bono, H.I. Sher, R.B. Montogomery et al. // Clin Cancer Res. – 2008, № 14. – P. 6302.
10. Budd G. Thomas. Circulating Tumor Cells versus Imaging - Predicting Overall Survival in Metastatic Breast Cancer / G. Thomas Budd, Massimo Cristofanilli, Mathew J.Ellis et al. // Clin Cancer Res. – 2006. – Vol.21, № 12. – P. 6403.
Взаимодействие опухоли и организма опухоленосителя является одной из важнейших фундаментальных проблем онкологии. Очевидно, что, несмотря на многочисленные барьерные и защитные механизмы, включая иммунные, опухоль растет и метастазирует. Среди сложных механизмов этого процесса, имеющих особенности в зависимости от локализации, гистологического строения, пролиферативных характеристик, иммунофенотипа, молекулярно-биологических и других особенностей опухоли, представляются важными те, которые действуют на этапе циркуляции опухолевых клеток в крови, где они находятся в окружении иммунокомпетентных клеток.

Детекция ЦОК в крови больных представляет собой вариант «жидкостной биопсии», позволяющей в ранние сроки предсказывать возникновение рецидива заболевания, прогнозировать течение болезни, осуществлять мониторинг эффективности терапии. Количество ЦОК используют как независимый высокоспецифичный прогностический фактор при раке молочной железы [8] (), простаты [9] и толстой кишки [7]. Обнаружение ЦОК в крови больных раком молочной железы, предстательной железы и толстой кишки может служить не только маркером распространенности опухолевого процесса и оценки эффективности проводимого лечения, но и индикатором активности опухолевого процесса и его стабилизации, даже при наличии дистантных метастазов [3].

Первой системой для непосредственного определения ЦОК в крови пациентов стала система CellSearchTM (Janssen Diagnostics, Inc.), которая утверждена для применения при трёх локализациях злокачественных опухолей: раке молочной железы, простаты и толстой кишки. Поскольку принцип работы системы CellSearchTM связан с наличием на поверхности ЦОК маркеров  адгезии эпителиальных клеток EpCAM и цитокератинов 8,18,19, можно ожидать успешной детекции всех опухолевых клеток, несущих данные молекулы (гландулярный эпителий пищеварительного, респираторного, урогенитального тракта; эндокринные и экзокринные клетки, мезотелий).

Интерес исследователей к РЛ закономерен: он занимает лидирующее место в смертности от онкологического заболевания по всему миру [10], а пятилетняя выживаемость составляет менее 5 и 15 % для мелкоклеточного (МРЛ) и немелкоклеточного (НМРЛ) рака лёгкого соответственно [6] [5].

В последние годы доказано, что в  процессе опухолевого роста нередко развиваются механизмы, обеспечивающие «ускользание» опухолевых клеток от надзора со стороны иммунной системы [2]. Хотя антигены опухолевых клеток и распознаются иммунной системой, элиминация их происходит не всегда, так как механизмы, направленные на уничтожение опухолевых клеток, могут играть противоположную роль, способствуя ее сохранению и прогрессии [1]. Кроме того, опухоль по своему составу гетерогенна, что создает предпосылки для естественного отбора определенных клеточных клонов, наиболее приспособленных к окружающим условиям [4]. Поиск механизмов, влияющих на диссеминацию опухолевых клеток в кровяном русле, важен как для снижения вероятности возможного прогрессирования, так и для определения новых прогностических факторов, а понимание участников и процессов, вовлеченных в метастазирование, может привести к эффективным, целевым подходам в его лечении и профилактике.

Цель исследования. Оценить частоту выявления ЦОК при генерализованных формах рака легкого, а также их взаимоотношение с иммунокомпетентными клетками крови.

Материалы и методы исследования: Исследование проведено 20 больным раком легкого IV стадией заболевания (Т2-3N2-3M1) в возрасте от 52 до 75 лет.  У 11 человек (55 %) гистологический тип опухоли соответствовал немелкоклеточному раку, у 9 (45 %) -  мелкоклеточному. Анализ образцов крови на наличие ЦОК осуществляли на системе CellSearch с использованием набора реагентов CELLSEARCH® CTC Kit. Число выявленных ЦОК являлось конечным результатом. По количеству  ЦОК больные были разделены на группы с низким количеством (до 10) ЦОК, со средним (от 11 до 100) ЦОК, и высоким (cвыше 100) ЦОК. Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов определяли на проточном цитометре BD FACSCantoII. Протоколы интерпретации данных включали определение основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови, количества Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+CD127dim), NKT-клеток, двойных негативных CD3+/CD4-/CD8- (DN) и двойных позитивных CD3+/CD4+/CD8+ (DP) T-лимфоцитов, количества активационных маркеров (CD25, CD38, CD95, HLADR) на Т-хелперах (CD3+СD4+) и ЦТЛ (CD3+СD8+). Результаты выражали в процентах от общего количества лимфоцитов, а для T-регуляторных клеток в процентах от CD3+CD4+ клеток. Статистический и корреляционный анализ результатов исследования проводили с помощью программы STATISTICA 7.0 (StatSoft Inc., США), статистически достоверные различия принимали при р<0,05; при коэффициенте корреляции (r) от 0,91 до 1,00 теснота связи определялась как очень сильная, от 0,81 до 0,90 - весьма сильная, от 0,65 до 0,80 - сильная, от 0,45 до 0,64 - умеренная, от 0,25 до 0,44 - слабая, до 0,25 - очень слабая.

Результаты и обсуждение

ЦОК были выявлены у 16 из 20 больных раком легкого (80 %) в количестве от 1 до 980 клеток в 7,5 мл крови, при НМРЛ у 10 из 11 (в 91 %), при МРЛ у 6 из 9 человек (в 66,7 %). Доля больных раком легкого с количеством ЦОК от 1 до 10 клеток составила 50 % (8 из 16 больных), с уровнем ЦОК от 11 до 100 и свыше 100 клеток, по 25 % (4 из 16 больных). При МРЛ количество ЦОК находилось в пределах от 1 до 980, тогда как при НМРЛ от 1 до 13 клеток. Среди больных МРЛ с выявленными ЦОК преобладали те, у кого количество превышало 100 клеток (в 66,6 % случаев, у 4 из 6 больных), тогда как с наименьшим и средним количеством ЦОК их отмечалось по 16,7 % (по 1 из 6 больных для каждой группы). У больных НМРЛ нами выявлена обратная закономерность. В этой группе у 80 % больных (у 8 из 10) уровень ЦОК соответствовал низким и у 20 % (у 2 из 10) средним значениям. Больные с высокими значениями ЦОК среди НМРЛ отсутствовали.

Сравнение показателей клеточного иммунитета у больных РЛ при обнаружении у них различного количества ЦОК показало ряд статистически значимых различий, несмотря на немногочисленность наблюдений. Так, из табл.1 видно, что при высоком уровне ЦОК отмечено достоверно более низкое процентное содержание CD3+CD4+ лимфоцитов по сравнению с показателями больных, у которых ЦОК были обнаружены в количествах до 100. Противоположные различия отмечены для CD3+CD8+CD38+, хотя по общей субпопуляции CD3+CD8+ лимфоцитов они не установлены. Как видно из табл.1, уровень лимфоцитов с иммунофенотипом активированных цитотоксических Т-клеток статистически достоверно (в 2-3 раза) выше у больных с максимальным содержанием ЦОК по сравнению с остальными группами. Обращают на себя внимание более низкие значения ряда показателей у больных со средними значениями уровней ЦОК, однако, статистически достоверные различия выявлены только для В-лимфоцитов, относительное содержание которых в 3 раза ниже, чем в остальных группах, а также для Т-regs, количество которых было в 2 раза ниже, чем у больных с высоким содержанием ЦОК. При этом у больных со средними уровнями ЦОК обнаружено более высокое содержание Т-лимфоцитов обеих основных субпопуляций с маркерами поздней активации CD3+CD4+HLA-DR+ и CD3+CD8+HLA-DR+, которое вследствие значительной индивидуальной вариабельности определялось в виде тенденции. Результаты относительного содержания иммунологических параметров в зависимости от количества выявленных ЦОК представлены в табл.1.                   

Таблица 1

Показатели иммунного статуса больных раком легкого в исследуемых группах, %

Исследуемые иммунологические параметры

Количество выявленных ЦОК

˂10 ЦОК

11˂ЦОК˂100

˃100 ЦОК

CD3+

70,94±7,84

81,6±10,89

70,7±15,12

CD3+/CD4+

42,24±4,55

44,7±2,55

28,95±3,75 *↓°↓

T-reg (от CD4)

8,3±3,76

5,2±2,12

10,3±1,13 °↑

CD3+/CD4+/CD38+

33,66±9,95

27,8±22,77

29,1±4,1

CD3+/CD4+/HLA-DR+

7,82±0,7

17,7±5,23

9,95±0,21

CD3+/CD4+/CD25+

5,26±0,71

3,55±1,77

8,05±5,59

CD3+/CD4+/CD95+

71,76±6,41

77,45±23,55

78,45±2,33

CD3+/CD8+

25,28±8,25

32,4±10,32

35,5±14,71

CD3+/CD8+/CD38+

17,1±6,39

11,65±3,04

30,65±2,9 *↑ °↑

CD3+/CD8+/HLA-DR+

25,38±10,25

33,3±4,67

21,65±9,83

CD3+/CD8+/CD25+

3,72±1,93

4,2±3,54

5,4±5,8

CD3+/CD8+/CD95+

84,42±5,28

86,3±2,26

86,0±5,37

CD(16+56)+

16,08±9,68

13,5±10,61

16,8±15,27

CD3+/CD(16+56)+

5,58±1,1

5,65±1,2

14,95±10,39

CD19+

11,86±4,46

3,75±0,92 *↓

11,2±1,27 °↑

CD3+/CD4-/CD8-

2,25±1,2

3,65±3,61

3,1±0,85

CD3+/CD4+/CD8+

0,64±0,19

1,5±1,56

2,3±2,83

ИРИ

1,84±0,59

1,5±0,57

0,9±0,28

 Примечание.* - разница показателей достоверна по отношению к группе  с количеством до 10 ЦОК (p≤0,05).

° -  разница показателей достоверна по отношению к группе с количеством от 11 до 100 ЦОК (p≤0,05).

При проведении корреляционного анализа наличия в крови больных ЦОК и иммунологическими параметрами выявлена сильная отрицательная корреляционная связь (r -0,87) между присутствием в крови ЦОК и CD3+CD4+ клеток. Подобная закономерность наблюдается и для ИРИ (r -0,53). Сильная положительная корреляция (r 0,78) обнаружена между лимфоцитами с иммунофенотипом активированных цитотоксических Т-клеток и наличием ЦОК. Результаты корреляционного анализа связи иммунологических параметров и наличия  ЦОК представлены в табл. 2.

Таблица 2

Корреляционная связь исследуемых иммунологических параметров и ЦОК

Исследуемые иммунологические параметры

ЦОК

CD3+

-0,30

CD3+/CD4+

-0,87

T-reg (от CD4)

0,39

CD3+/CD4+/CD38+

-0,08

CD3+/CD4+/HLA-DR+

-0,05

CD3+/CD4+/CD25+

0,74

CD3+/CD4+/CD95+

0,20

CD3+/CD8+

0,19

CD3+/CD8+/CD38+

0,78

CD3+/CD8+/HLA-DR+

-0,14

CD3+/CD4+/CD25+

0,45

CD3+/CD4+/CD95+

-0,04

CD(16+56)+

0,24

CD3+/CD(16+56)+

0,49

CD19+

0,10

CD3+/CD4-/CD8-

0,02

CD3+/CD4+/CD8+

0,67

ИРИ

-0,53

Как видно из табл. 2, уровень ЦОК демонстрирует сильную корреляционную связь с некоторыми минорными субпопуляциями лимфоцитов: CD3+CD4+CD25+ (r 0,74) и CD3+CD4+CD8+ (r 0,67), при этом показана умеренная корреляция с CD3+CD8+CD25+ (r 0,45) и CD3+CD16/56+, т.е. NKT (r 0,49). Последнюю можно рассматривать как артефакт, т.к. высокий процент NKT-клеток был, вероятно, компенсаторным при низком уровне NK лимфоцитов и обнаружен только у 1 больного, у которого при этом определялось высокое количество ЦОК.

Заключение

Таким образом, проведенное исследование с использованием системы CellSearch показало высокую частоту выявления ЦОК у больных раком легкого. У больных НМРЛ в 1,4 раза чаще выявлялись опухолевые клетки в крови, в сравнении с МРЛ, при этом при НМРЛ преобладающим являлся низкий уровень ЦОК, тогда как при МРЛ - высокий. Высокий уровень ЦОК характеризовался достоверно более низким относительным содержанием CD3+CD4+ лимфоцитов, а также достоверно высоким содержанием T-reg и CD19+ лимфоцитов. Количество Тregs клеток, с которыми, по современным представлениям, связана иммунодепрессия и прогрессирование опухоли, не продемонстрировали ни статистически достоверных различий, ни корреляций с наличием ЦОК, однако, выявленная положительная корреляционная связь последнего с долей лимфоцитов, экспрессирующих CD4+CD25+, позволяет предположить участие Тregs в процессе гематогенного метастазирования, тем более, что она выявлена на фоне отрицательной корреляции с общим количеством лимфоцитов Т-хелперно-индукторной субпопуляции (CD3+CD4+).  У больных с высокими значениями ЦОК выявленная положительная корреляция уровней DP (CD3+CD4+CD8+) лимфоцитов и ЦОК, по-видимому, связана с увеличением выброса незрелых клеток из тимуса, возможно, компенсаторным. Этим же можно объяснить и повышение уровня CD3+CD8+CD38+ клеток, однако, то обстоятельство, что подобные изменения не распространяются на лимфоциты с фенотипом CD3+CD4+CD38+, говорит о нарушении Т-хелперного звена еще на уровне посттимических предшественников. Полученные нами результаты о повышении содержания клеток этой субпопуляции на фоне высокого уровня ЦОК в целом соответствуют представлениям об их негативной роли при распространенных опухолевых процессах. Несмотря на полученные данные, исследования, направленные на определение уровня ЦОК в сочетании с детальной оценкой иммунного статуса для расширения представлений о механизмах метастазирования, и как следствие, поиска подходов для их профилактики, должны быть продолжены.

Рецензенты:

Шихлярова А.И., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изыскания новых противоопухолевых средств ФГБУ «РНИОИ» Минздрава РФ, г. Ростов-на-Дону;

Николаева Н.В., д.м.н., ассистент кафедры онкологии   ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава РФ, г. Ростов-на-Дону.


Библиографическая ссылка

Бахтин А.В., Кит О.И., Новикова И.А., Златник Е.Ю., Исаева Р.Г., Селютина О.Н., Шульгина О.Г. ДЕТЕКЦИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КРОВИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК И ИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЕ С ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ У БОЛЬНЫХ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМИ ФОРМАМИ РАКА ЛЕГКОГО // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 3. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=19734 (дата обращения: 18.05.2022).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074