Введение
В системе стресс-лимитирующих механизмов определенное место занимают антиоксидантные факторы неспецифической защиты [1, 4].
В целях выяснения характера неспецифического действия на систему крови относительно низких концентраций химических веществ нами изучался широко распространенный в практике антиокислитель– 2,6-ди-трет-бутил-п-крезол, бутилированный окситолуол, алкофен БП, бибунол (ионол) [3]. В связи с тем, что многие патологические процессы и стрессовые состояния в организме сопровождаются кислородным голоданием тканей, параллельно нами было исследовано действие ионала в норме и в условиях гипоксии [2].
Материал и методы исследования
В качестве гипоксии использовалась экспериментальная модель – постгеморрагическая анемия, которая вызывалась путем одномоментной некомпенсированной кровопотерей. Кровопускание производилось из краевой ушной вены кроликов породы «Шиншилла» способом надреза из расчета 20% от массы крови. Общее количество крови в организме кролика определялось исходя из массы тела (5,4%). Экспериментальные животные получали небольшие дозы препарата внутримышечно в течение 10 дней ежедневно. В совокупности были составлены следующие группы:
I -группа: 150 мг/кг ионола ( п-10).
II -группа: 100 мг/кг ионола ( п-10).
III -группа: 60 мг/кг ионола ( п-10).
IV -группа: животные после кровопотери (контроль) ( п-10).
Используемый диапазон концентрации ионола был ориентирован на установление негативной, интактной и лечебной для организма доз препарата. Исследование крови производилось в исходном состоянии и через 1, 3, 5, 7, 9, 10 суток при инъекции изучаемого вещества, а в опытах с кровопотерей – в исходном состоянии и через 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 суток с начала введения препарата.
Определение достоверности различий количественных показателей проводилось по t– критерию Стьюдента [5].
Результаты исследования
Дозы ионола, соответствующие 60, 100 мг/кг, достоверных сдвигов в показателях периферической крови не вызывали (Р>0,05), (Р<0,05). При введении ионола в концентрации 150 мг/кг были отмечены достоверные изменения со стороны форменных элементов циркулирующей крови (табл. 1). Уже на 2-3 сутки опыта количество эритроцитов начинало уменьшаться и на 10 сутки принимало минимальное выражение. Дефицит эритрона в этот срок в среднем равнялся 1,0х1012/л (22,2%) (Р<0,05) и одновременно сопровождался ретикулоцитозом (Р<0,05). Количество ретикулоцитов на 10 сутки увеличилось и составило 36,3%. Содержание гемоглобина в крови у подопытных животных имело тенденцию к уменьшению. Как и у других показателей красной крови, количество гемоглобина наиболее заметно снижалось на 10 сутки. Дефицит содержания гемоглобина в этот срок в среднем составлял 2,0% (Р<0,05). Общий объем эритроцитов (по гематокриту) постепенно уменьшался и на 10 сутки принимал минимальную величину (в среднем 25,4 ед. Р<0,05)). Средний диаметр эритроцитов подопытных кроликов имел тенденцию к уменьшению, и на 10 сутки опыта в среднем равнялся 6,1 мк (Р<0,05). При этом нормоциты составляли 46,1% (6,0 – 7,0 мк), макроциты – 24,3% (7,1 – 8,5), микроциты – 29,6% (5,9 – 4,8 мк) (Р<0,05). Итак, по сравнению с исходным состоянием увеличивался уровень анизоцитоза, больше стало макроцитов и микроцитов при соответствующим снижении относительного числа нормоцитов (табл. 1).
Следовательно, концентрация ионола в дозе 150 мг/кг обусловливала эритроцитопению, ретикулоцитоз, микроцитоз, анизоцитоз и снижение содержания гемоглобина в крови, особенно в 1 эритроците.
Параллельное изучение лейкоцитов крови кроликов при введении ионола 150 мг/кг показало определенные изменения как количественного, так и качественного характера. Они носили обратно пропорциональный характер количественным изменениям красной крови. Наибольшему дефициту эритрона соответствовало максимальное повышение количества лейкоцитов. На 10 сутки опыта число лейкоцитов по сравнению с исходным уровнем повышалось в среднем на 2,4 х 109/л. (Р<0,05).
Таблица 1
Показатели крови кроликов при введении ионола-150 мг / кг
(М ± m; п-10; *- Р < 0,05 в сравнении с исходным уровнем )
|
Показатели крови |
Исходный уровень |
1 сут |
3 сут. |
5 сут. |
7 сут. |
9 сут. |
10 сут. |
|
Эритроциты (х1012 /л) |
4,7±0,08 |
4,4±0,07* |
4,2±0,06* |
4,1±0,06* |
3,9±0,05* |
3,7±0,07* |
3,7±0,6* |
|
Гемоглобин крови (г%) |
10,8±0,21 |
10,1±0,22 |
9,6±0,19* |
9,5±0.18* |
9,3±0,22* |
8,7±0,19* |
8,8±0,18* |
|
Средн.конц.гемогл. в 1 эр-те (г/л) |
22,9±0,5 |
22,9±0,6 |
22,8±0,4 |
23,2±0,6 |
23,8±0,7 |
23,5±0,6 |
23,8±0,7 |
|
Средн.содерж.гемогл.в 1 эр-те(рг) |
270,2±5,9 |
261,1±5,8 |
249,8±5,4 |
241,5±5,5 |
236,7±5,6 |
231,3±5,4 |
228,6±5,5 |
|
Ретикулоциты (%о) |
30,5±0,61 |
28.4±0,57* |
29,5±0,58 |
33,8±0,63* |
35,1±0,65* |
36,2±0,62* |
36,3±0,66* |
|
Лейкоциты х109/л) |
6,4 ±0,11 |
6,9±0,13* |
7,1±0,15* |
7,4±0,16* |
7,9±0,14* |
8,1±0,12* |
8,8±0,16 |
|
Гематокрит ус.ед.) |
29,1±0,58 |
28,2±0,55 |
27,8±0,59* |
26,1±0,54* |
25,9±0,55* |
25,7±0,58* |
25,4±0,53* |
|
Ср.диам.эритр.(мкм) |
6.6±0,12 |
6,2±0,13* |
7,1±0,15* |
6,5±,11 |
6,2±0,13* |
6,1±0,14* |
6,1±0,11* |
|
Нормоциты (%) |
69,2±1,2 |
66,3±1,1* |
58,6±0,9* |
62,4±1,3* |
55,4±1,1* |
47,3±1,3* |
46,1±0,8* |
|
Макроциты (%) |
13,3±0,26 |
18,±,29* |
23,3±0,31* |
19,±,28* |
19,5±0,27* |
28,±,29* |
24,3±0,32* |
|
Микроциты (%) |
17,5±0,35 |
15,2±0,31* |
18,1±0,37 |
17,7±0,34* |
25,1±0,29* |
26,3±0,32* |
29,6±0,39* |
|
СГК гликогена (пседоэозинофилы) |
2,29±0,04 |
2,28±0,03 |
2,15±0,02* |
2,11±0,03* |
2,14±0,03* |
1,96±0,04* |
1,93±0,03* |
|
СГК миелоперокс. (псевдоэозиноф.) |
2,9±0,06 |
2,9±0,05 |
3,1±0,07* |
3,1±0,08* |
3,2±0,07* |
3,2±0,05* |
3,3±0,07* |
|
СГК шелочной фосфатазы (псевдоэозиноф.) |
0,38±0,008 |
0,39±0,007 |
0,41±0,009* |
0,41±0,007* |
0,42±0,006* |
0,43±0,007* |
0,43±0,007* |
Таблица 2
Лейкоцитограмма при действии ионола-150 мг/кг
(М ±m; n-10; *-Р < 0,05 в сравнении с исходным уровнем)
|
Виды лейкоцитов (%) |
Исходный уровень |
3 сут. |
7 сут. |
10 сут. |
|
Базофилы |
2,5±0,048 |
2,2±0,042* |
2,1±0,041* |
1,1±0,038* |
|
Эозинофилы |
0.4±0,007 |
0,2±0,005* |
0,2±0,004* |
0,5±0,008* |
|
Псевдоэозинофилы юные |
- |
- |
0.2±0,003 |
0,7±0,009 |
|
Псевд.палочкоядерные |
0,9±0,018 |
2,3±0,032* |
2,3±0,036* |
2,8±0,039* |
|
Псевд.сегментоядерные |
31,2±0,63 |
31,9±0,67 |
31,3±0,61 |
30,8±0,59 |
|
Лимфобласты |
0,3±0,006 |
0,7±0,014* |
1,3±0,028* |
1,6±0,031* |
|
Пролимфоциты |
9,1±0,17 |
9,7±0,19* |
10,1±0,21* |
11,9±0,25* |
|
Лимфоциты |
49,7±0,91 |
46,2±0,98* |
43,8±0,83* |
42,3±0,87* |
|
Моноциты |
5,1±0,11 |
5,1±0,12 |
6,±,14* |
7,2±0,16* |
|
Деструкт.лейкоциты |
0,8±0,016 |
1,6±0,021* |
1,8±0,029* |
2,2±0,031* |
Рис.1. Показатели гемоглобина при введении ионола – 150мг/кг.
Ряд 1 – через 10 суток. Ряд 2 – исходный уровень.
1 – гемоглобин крови (г/л).
2 – средняя концентрация гемоглобина в 1 эритроците (г/л).
3 – среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците (рг)
Цитохимические исследования при введения ионола (150, мг/кг) показали снижение содержания гликогена и некоторое повышение активности ферментов пероксидазы и щелочной фосфатазы в псевдоэозинофилах, что отражает усиление внутриклеточного обмена (Р<0,05) (табл. 1). В лейкоцитограмме наблюдалось увеличение относительного числа псевдоэозинофилов, моноцитов, деструктивных лейкоцитов (Р<0,05) при соответствующем понижении содержания лимфоцитов (Р<0,05). Одновременно происходил сдвиг «влево» в нейтрофилограмме и лимфоцитограмме (Р<0,05) (табл.2).
Процентное содержание деструктивных лейкоцитов в периферической крови здоровых кроликов составляло в среднем 0,8%. В условиях введения ионола относительное число их повышалось. На 10 сутки оно приобретало максимальное значение в среднем 2,3% (Р<0,05). Это происходило в состоянии наибольшего дефицита эритрона. Повышенное содержание деструктивных лейкоцитов периферической крови в условиях гипоксии, обусловленной введением ионола, отражало более высокий уровень обновления белой крови вследствие более быстрого изнашивания и альтерации в связи с функциональным напряжением. Таким образом, в периферической крови кроликов, как в норме, так и в эксперименте, циркулировало некоторое количество деструктивных лейкоцитов, которые отражали резорбтивную фазу физиологической, а также репаративной регенерации белой крови. Разные формы деструктивных лейкоцитов обуславливались, во-первых, преобладанием одного из стереотипных процессов клеточной альтерации – коагуляции и колликвации, а во-вторых, неравномерным распадом ядра и цитоплазмы. Существовала прямо пропорциональная зависимость между числом деструктивных лейкоцитов в циркулирующей крови и лейкоцитарной реакцией. Усиление регенерации белой крови сопровождалось повышением числа деструктивных лейкоцитов. Некробиозу лейкоцитов предшествовали дистрофические изменения внутриклеточных структур. Наиболее ранние деструктивные изменения возникали в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме. Однако определенные дистрофические изменения в лейкоцитах могли быть проявлением репарации структурных элементов клетки и носить обратимый характер.
Следовательно, применение антиокислителей небезразлично для организма. В физиологических концентрациях биоантиоксиданты необходимы для осуществления ферментативного окисления клеточного дыхания и, как правило, или стимулирует, или нормализует его. Однако при длительном действии относительно высоких концентраций антиокислителей может наступить снижение синтеза в организме собственных антиоксидантов, что повлечет усиление свободнорадикального окисления. Но и чрезмерное преобладание биологического окисления при резком угнетении свободнорадикального окисления может привести к нарушению постоянства уровня суммарной антиокислительной активности тканей, что служит одним из основных условий физиологического гомеостаза. Кроме того, некоторые продукты переокисления, в частности, перекиси липидов, являются промежуточными продуктами гормонов, простогландина Е и прогестерона. Они также участвуют в гидроксилировании астероидного ядра холестерина. Перекиси, образовавшиеся в результате неферментативного окисления, могут выступать в роли неспецифических участков обмена, например, в фаго- и пиноцитозе, регулируя проницаемость мембран лизосом. Таким образом, значительное и длительное изменение антиокислительного эффекта определяется не количеством антиокислителя, а тем, насколько фактически удается усилить систему естественных тканевых биоантиокислителей.
Многие патологические процессы в организме сопровождаются кислородным голоданием тканей. При этом часто изменяется соотношение биологического ферментационного и свободнорадикального окисления. В связи с этим нами было предпринято исследование действия ионола в условиях гипоксии. Для этого была создана экспериментальная модель циркуляторно гипоксии – постгеморрагическая анемия. Анемизированным животным вводились небольшие дозы – 30 мг/кг, которые в целом оказывали благоприятное действие на течение анемии и восстановление крови.
Изучение состояния красной крови показало, что через 3 суток после кровопускания среднее количество эритроцитов составляла 2,8х1012/л, тогда как при введении 30 мг/кг ионола оно соответствовало 3,5х1012/л, (Р<0,05), что указывает на значительное снижение уровня дефицита эритрона. В последующие сутки опыта темпы восстановления количества эритроцитов у животных, получавших ионол, заметно ускорились по сравнению с контрольной группой. Так, через 15 суток после кровопускания число эритроцитов в крови у контрольной группы в среднем равнялась 3,9х1012/л, тогда как при введении ионола в дозе 30 мг/кг этот показатель соответствовал 4,4х1012/л. (Р<0,05).
Таблица 3
Показатели крови кроликов при введении ионола-30 мг/кг после кровопотери
(М±m ; n-10; *- р<0,05 в сравнении с исходным уровнем)
|
Показатели крови |
Исходн. уровень |
1 сут. |
5 сут. |
7 сут. |
9 сут. |
11 сут |
15 сут. |
|
Эритроциты (х1012 /л) |
4,7±0,11 |
3,4±0,08* |
3,3±0,1* |
3,6±0,09* |
3,7±0,07* |
3,7±0.08* |
3,9±0,09* |
|
Эритроциты (х1012 /л)-ионол |
4,6±0,09 |
3,6±0,07* |
3,7±0,08* |
4,1±0,08* |
4,4±0,11* |
4,4±0,12* |
4.4±0,11* |
|
Гемоглобин (г%) |
11,7±0,21 |
2,6±0,18* |
7,7±0,15* |
8,1±0,16* |
8,6±0,19* |
8.7±0,08* |
10,1±0,19* |
|
Гемоглобин (г%)-ионол |
11,6±0,19 |
8,2±0,15* |
88,2±0,17* |
8,8±0,18* |
9,3±0,18* |
9,8±0,17* |
10,9±0,18* |
|
Гематокрит (ус.ед.) |
29,3±0,61 |
22,1±0,55* |
17,9±0,51* |
18,8±0,52* |
20,1±0,51* |
23,8±0,53* |
26,9±0,58* |
|
Гематокрит (ус.ед.)-ионол |
29,5±0,59 |
25,9±0,61* |
27,5±0,57* |
27,3±0,62* |
27,8±059* |
28,1±0,56* |
28,9±0,6* |
|
Ретикулоциты (%о) |
29,9±0,68 |
25,6±0,53 |
41,1±0,72* |
34,2±0,73* |
31,1±0,71* |
30,8±0,61* |
30,1±0.66* |
|
Ретикулоциты (%о)-ионол |
30,2±0,66 |
29,1±0,59 |
44,.5±0,72 |
47,1±0,64* |
45,2±0,69* |
41,8±0,58* |
41,2±0,61* |
Таблица 4
Коэффициенты парной корреляции по шкале отношений (r-факт.) после кровопускания и введения ионола 30 мг/кг
|
Сроки исследования |
Эритроциты-лейкоциты |
Эритроциты-гемоглобин |
Эритроциты-ретикулоциты |
Критич.коэфф.корреляции 5% значимости (r крит) (К=10-2) [4]. |
|
Исходное состояние |
< 0,813 |
< 0, 904 |
< 0,731 |
0,63 |
|
Через 5 суток |
< 0,905 |
< 0,776 |
< 0,739 |
0,63 |
|
Через 10 суток |
< 0,794 |
< 0,862 |
< 0, 804 |
0,63 |
|
Через 15 суток |
< 0,729 |
< 0,791 |
< 0, 842 |
0,63 |
Примечание. Коэффициенты парной корреляции полученных данных больше, чем величина критического коэффициента при Р – 0,05, что подтверждает достоверность тесноты связей.
Содержание гемоглобина в крови после кровопускания (контроль) и при введении ионола анемизированным животным было неодинаково. Различия содержания гемоглобина в известной степени повторяли сдвиги со стороны количества эритроцитов. Через 3 суток после кровопускания содержание гемоглобина в крови контрольных животных в среднем равнялось 6,1 г%, а при введении ионола – 7,6 г% (Р<0,05). Через 15 суток опыта описываемый показатель у контрольной группы составлял 10,1 г%, а при введении ионола –
10,9 г% (Р<0,05).
Общий объем эритроцитов (по гематокриту) в различных условиях опыта, как и содержание гемоглобина, претерпевал изменения, аналогичные сдвигам эритроцитов. Через 3 суток после кровопускания общий объем эритроцитов у контрольных животных составлял в среднем 17,3 ед., а при введении ионола – 27,6 ед. (Р<0,05). Через 15 суток этот показатель у контрольной группы равнялся 26,9 ед., а при введении ионола – 28,9 ед. (Р<0,05). Количество ретикулоцитов в крови у всех групп имела тенденцию к повышению. Однако наблюдаемый ретикулоцитоз при введении ионола имел некоторые особенности. У контрольной группы повышение содержания ретикулоцитов наблюдалось в первые 10-11 суток после кровопускания, а при введении ионола состояние ретикулоцитоза отмечалось в продолжение 15-17 суток. Так, у контрольных животных концентрация зернистых эритроцитов через 15 суток опыта составляла в среднем 30,1%, а при введении ионола – 41,2% (Р<0,05). Таким образом, введение ионола животным после кровопотери обусловливало снижение уровня анемии в первые сутки опыта и ускоряло темпы восстановления красной крови (табл. 3).
Выводы
1. Концентрация ионола в дозе 150 мг/кг обуславливала эритроцитопению, ретикулоцитоз, небольшой микроцитоз, анизоцитоз и некоторое снижение содержания гемоглобина в крови в целом и особенно в 1 эритроците.
2. При концентрации ионола 150мг/кг наибольшему дефициту эритрона соответствовало максимальное повышение количества лейкоцитов.
3.Цитохимические исследования при введении ионола (150, мг/кг) показали снижение содержания гликогена и некоторое повышение активности ферментов пероксидазы и щелочной фосфатазы в псевдоэозинофилах, что отражает усиление внутриклеточного обмена.
4. Введение ионола (30 мг/кг) животным после кровопотери обусловливало снижение уровня анемии в первые сутки опыта и ускоряло темпы восстановления красной крови.
Рецензенты:
Фролов Б.А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патофизиологии Оренбургской государственной медицинской академии, г. Оренбург.
Миннебаев М.М., д.м.н., профессор кафедры патофизиологии Казанского государственного медицинского университета, г. Казань.