Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОСТОРОННЕЙ ПРИМЕСИ В СУБСТАНЦИИ АМИДА N–АЛЛИЛАНТРАНИЛОВОЙ КИСЛОТЫ

Карпенко Ю.Н. 1 Басс С.М. 1 Ярыгина Т.И. 1
1 ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Синтезировано новое биологически активное соединение амид N–аллилантраниловой кислоты (АNААК). Постороннюю примесь (исходный продукт синтеза) – амид антраниловой кислоты (ААК) определяли обращённо-фазной ВЭЖХ. Анализ проводили на колонке С18 (25 см×4,6 мм, сорбент Discovery® С18 с размером частиц 5 мкм). Подвижная фаза: ацетонитрил – 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты (30:70), скорость потока подвижной фазы – 1 мл/мин, длина волны детектирования – 212 нм, объем вводимой пробы – 20 мкл, температура термостата колонки – 40 °С. Линейность разработанной методики определяли на пяти уровнях концентраций ААК в пределах 0,05-0,5% от содержания основного вещества – субстанции АNААК. Предел обнаружения и количественного определения ААК составил соответственно 0,5 мкг/мл и 1 мкг/мл. Оценку повторяемости методики проводили в пределах концентраций ААК 1-10 мкг/мл. Относительное стандартное отклонение не превышает 10,0%. Определение правильности методики проводили на трех уровнях содержания ААК в АNААК (0,05, 0,1 и 0,5%). Границы открываемости ААК не выходят за пределы 75–125%, рекомендованные при количественном определении примесей с нормой содержания от 0,1 до 1%.
обращённо-фазная ВЭЖХ
валидация
амид N-аллилантраниловой кислоты; амид антраниловой кислоты
1. Басс С.М. Разработка методов оценки качества субстанции амида N–аллилантраниловой кислоты / С.М. Басс, Т.И. Ярыгина, Л.М. Коркодинова [и др.] // Вестн. Рос. ун-та дружбы народов. Сер. Медицина. – 2010. – № 4. – С. 165-167.
2. Басс С.М. Изучение УФ-спектров нового биологически активного амида N-аллилантраниловой кислоты в применении к его идентификации // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2011. – № 8. – С. 104-105.
3. Государственная Фармакопея РФ / М-во здравоохранения Рос. Федерации. – 12-е изд., репринт. – М. : Научный центр экспертиз средств медицинского применения, 2008. – Ч. 1 – 704 с. : ил.
4. Курбатов Е.Р. Синтез, физико-химические свойства и биологическая активность амида N- аллилантраниловой кислоты / Е.Р. Курбатов, А.Б. Шакирова, Л.М. Коркодинова [и др.] // Вестн. Рос. ун-та дружбы народов. Сер. Медицина. – 2010. – № 4. – С. 295-297.
5. Амид N-аллилантраниловой кислоты, проявляющий противовоспалительную, анальгетическую и антигипоксическую активности / А.Б. Шакирова, Л.М. Коркодинова, М.Ю. Васильева [и др.] ; Перм. гос. фармац. акад. : Пат. 2180656. № 2000119954 ; заявл. 26.07.00 ; опубл. 20.03.02 ; приор. 26.07.00 (Россия). – 3 с.

Введение

В результате поиска биологически активных соединений в ряду амидов
N-замещенных антраниловых кислот [4; 5] выявлено соединение, проявившее наибольший противовоспалительный эффект – амид N–аллилантраниловой кислоты (АNААК). В связи с рекомендацией к проведению доклинических испытаний нами проводятся исследования по разработке методов контроля качества и стандартизации субстанции и лекарственных форм этого соединения [1].

Исходя из схемы получения АNААК, посторонней (специфической) примесью в его субстанции может быть амид антраниловой кислоты (ААК).

Целью настоящей работы явилась разработка и валидация методики определения посторонней примеси ААК в субстанции АNААК методом обращённо-фазной ВЭЖХ.

Материалы и методы исследования

В исследованиях использовался высокоэффективный жидкостный хроматограф «Shimadzu LC Prominence» (Япония), оснащённый колонкой из нержавеющей стали (25 см×4,6 мм, сорбент Discovery® С18 с размером частиц 5 мкм) и диодноматричным детектором.

Для приготовления подвижных фаз использовали воду бидистиллированную, фосфорную кислоту концентрированную, трифторуксусную кислоту, ацетонитрил для хроматографии, метанол [3].

В работе использовали пять серий субстанции АNААК, синтезированные на кафедре фармацевтической химии ФОО ПГФА в 2008-2012 гг., ААК марки Lancaster Synthesis.

Результаты исследований и их обсуждение

Предварительный эксперимент показал, что оптимальным элюентом с точки зрения эффективного разделения аналитов, а также симметрии хроматографических пиков является подвижная фаза на основе ацетонитрила и 0,1%-ного раствора трифторуксусной кислоты в соотношении 30:70. УФ-спектры АNААК в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты характеризуются тремя максимумами поглощения 216 нм, 257 нм и 350 нм (Е1%1см соответственно 1520, 520 и 320) [2]. Длину волны детектирования (212 нм) выбирали, исходя из полученного спектра ААК в подвижной фазе (рис. 1). Хроматограмма раствора модельной смеси АNААК и ААК (по 200 мкг/мл) в элюенте представлена на рис. 2.

Разработанные условия хроматографического анализа:

- подвижная фаза: ацетонитрил – 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты (30:70);

- скорость потока подвижной фазы – 1 мл/мин;

- длина волны детектирования – 212 нм;

- объем вводимой пробы – 20 мкл;

- температура термостата колонки – 40 °С.

 

Рис. 1. УФ-спектр ААК в подвижной фазе ацетонитрил – 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты (30:70).

 

Рис. 2. Хроматограмма раствора модельной смеси АNААК и ААК (длина волны детектирования 212 нм).

Валидацию аналитической методики проводили по параметрам: специфичность, линейность, правильность, повторяемость (сходимость), предел обнаружения и предел количественного определения.

При подтверждении специфичности использовали модельную смесь субстанции АNААК (1 мг/мл) и примеси ААК (10 мкг/мл) в подвижной фазе (рис. 3).

Рис. 3. Хроматограмма модельной смеси АNААК (1 мг/мл) и примеси ААК (10 мкг/мл) в подвижной фазе.

Идентификацию ААК и АNААК на хроматограмме осуществляли путем сопоставления времён удерживания аналитов и стандартных образцов. Пик ААК в разработанных условиях имеет время удерживания 3,20 ±0,05 мин, пик АNААК – 6,72±0,05 мин. Анализ «холостой» хроматограммы (растворителя образца) показал отсутствие мешающих посторонних пиков. Коэффициент разрешения (Rs) пика примеси и основного вещества составил 5,4, что свидетельствует о хорошем разделении (рекомендуемое значение Rs при определении содержания примесей больше 2). Коэффициент асимметрии пика ААК, характеризующий надежность определения границ пика, равен 1,1 (рекомендуемое значение – от 0,8 до 1,5). Относительное стандартное отклонение (RSD) площадей пиков ААК для трёх последовательных хроматограмм составило 1,92%.

Линейность методики определяли на пяти уровнях концентраций ААК в подвижной фазе (0,05; 0,1; 0,25; 0,35; 0,5% от содержания основного вещества – субстанции АNААК). Для этого в мерные колбы вместимостью 25 мл помещали раствор ААК в метаноле с концентрацией 53,5 мкг/мл (0,5, 1,0, 2,5, 3,5 и 5,0 мл) и доводили объем колб метанолом до метки. Коэффициент корреляции составил 0,999, что свидетельствует о линейности методики в выбранном диапазоне концентраций (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость площади пика от концентрации ААК (мкг/мл) в модельных смесях.

Предел обнаружения ААК по предложенной методике составляет 0,5 мкг/мл (0,025% от содержания в субстанции АNААК), предел количественного определения 1 мкг/мл (0,05% от содержания в субстанции АNААК).

Оценку повторяемости методики проводили на модельных растворах ААК на четырех уровнях концентраций: 1, 2, 5 и 10 мкг/мл, что соответствует 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5% от содержания в субстанции АNААК. Каждый из растворов готовился в соответствии с тестируемой методикой и хроматографировался не менее 3 раз.

Относительное стандартное отклонение не превышает 10,0%, что свидетельствует об удовлетворительной сходимости результатов на всех уровнях рассматриваемых концентраций (табл. 1).

Таблица 1 – Оценка повторяемости (сходимости) методики определения ААК

Содержание ААК в растворе, мкг/мл

Найденное содержание ААК, мкг/мл

Метрологические характеристики

(P =0,95; n=6)

n

SD

RSD

ΔX

1

0,79; 0,87; 0,91;

0,78; 0,89;0,84

6

0,85

0,053

6,23

0,14

2

2,03; 1,93; 1,95;

2,04; 1,98; 1,95

6

1,98

0,046

2,32

0,12

5

4,84; 5,10; 4,90;

4,89; 5,06; 4,86

6

4,94

0,110

2,22

0,28

10

9,82; 9,88; 10,11;

10,07; 9,93; 9,78

6

9,93

0,133

1,34

0,34

При определении правильности методики (табл. 2) оценивали открываемость известного количества аналита (ААК), введенного в плацебо (субстанцию АNААК). Исследования проведены на трех уровнях содержания ААК в АNААК (0,05, 0,1 и 0,5%). По 0,05 г субстанции АNААК помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл, растворяли в 10 мл метанола, добавляли в каждую колбу раствор ААК в метаноле с концентрацией 50 мкг/мл (0,5, 1,0, 5,0 мл) и доводили объем колб метанолом до метки.

Таблица 2 – Оценка правильности методики определения ААК

Содержание ААК в растворе, мкг/мл

Открываемость

(R), %

Метрологические характеристики

(P =0,95; n=6)

n

SD

RSD

Δ

1

92,4; 83,6; 102,0;

93,1; 88,2; 96,1

6

92,3

5,83

6,31

6,11

2

94,5; 103,5; 103,0;

97,0; 94,0; 98,5

6

98,42

4,09

4,15

4,29

10

98,8; 99,7; 102,1;

99,1; 101,4; 99,7

6

100,13

1,32

1,32

1,38

Границы открываемости ААК не выходят за пределы 75–125%, рекомендованные при количественном определении примесей с нормой содержания от 0,1 до 1%.

Анализ пяти серий субстанции АNААК показал, что содержание в них посторонней примеси ААК не превышает 0,1%.

Разработанная методика включена в проект ФС на субстанцию АNААК.

Выводы

1. Установлены условия определения примеси ААК в субстанции АNААК методом обращённо-фазной ВЭЖХ.

2. Валидация разработанной методики по параметрам специфичность, линейность, предел обнаружения и предел количественного определения, повторяемость (сходимость), правильность показала её приемлемость для определения 0,05-0,5% примеси ААК в субстанции АNААК.

Рецензенты:

Вихарева Елена Владимировна, доктор фармацевтических наук, доцент, заведующий кафедрой аналитической химии ГБОУ ВПО «ПГФА» Минздрава России, г. Пермь.

Гейн Владимир Леонидович, доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой физической и коллоидной химии ГБОУ ВПО «ПГФА» Минздрава России, г. Пермь.


Библиографическая ссылка

Карпенко Ю.Н., Басс С.М., Ярыгина Т.И. РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОСТОРОННЕЙ ПРИМЕСИ В СУБСТАНЦИИ АМИДА N–АЛЛИЛАНТРАНИЛОВОЙ КИСЛОТЫ // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 1.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=8511 (дата обращения: 09.12.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074